Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) - экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met⁵-энкефалина-Arg⁶ [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met⁵-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr 100000 - 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co²⁺ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. K_m для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно.

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме).

Обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП [41, 101, 102]. У самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [88]. Активность фермента изменяется в период полового созревания. Экзогенные тестостерон и прогестерон вызывают снижение активности ФМСФ-КП [88]. Наиболее существенное изменение активности ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе.

Имеющиеся данные позволяют сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП в процессинге, а по некоторым данным и в катаболизме [101], предшественников ряда нейропептидов [41, 43, 47, 101, 102].

Для уточнения биологической роли ФМСФ-КП в норме и при патологии интересно исследовать ее активность у пренатальной алкоголизированных животных обоего пола.

1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе

Содержание биологически активных пептидов изменяется в процессе индивидуального развития организма. Эти возрастные изменения отличаются в разных органах, тканях и группах клеток. Причем наблюдается отличие онтогенетической динамики изменения уровней разных пептидов в одной ткани и одного и того же пептида в разных тканях. Несомненно, это связано с различной биологической ролью разных пептидов в пределах одной ткани и вовлечением одного и того же пептида в протекание разных процессов в разных тканях [52, 55, 76]. В онтогенезе существенно изменяются соотношения между уровнем биологически активных пептидов и их предшественников [266], или соотношение между уровнем пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310], что свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития.

мРНК препроэнкефалина в мозге крыс обнаруживается на Е15, сохраняется на этом уровне до Р14, а затем возрастает до уровня взрослых животных [351]. Продукты расщепления проэнкефалина обнаруживаются на ранних стадиях эмбрионального развития в мозге крыс [342]. Met-энкефалин появляется в мозге крыс на Р0, его уровень увеличивается к Р21 и далее медленно возрастает [347]. По другим данным [25, 267], его уровень повышается в гипофизе, снижается в коре головного мозга, гипоталамусе и спинном мозге, не изменяется в гиппокампе и стволе мозга. Leu-энкефалин появляется в гиппокампе крыс на Р4, его содержание увеличивается к Р18, в среднем мозге не изменяется [118].

В надпочечниках крыс в возрасте Р7-Р21 изменяется соотношение предшественник/зрелая форма Met-энкефалина, очевидно за счет изменения процессинга проформы. Это подтверждается и повышением активности КПН, которая вовлекается в его превращение [266]. При этом содержание Met-энкефалина-Arg⁶-Phe⁷ снижается в 4 раза, а Met -энкефалина - в 2 раза [266].

Содержание в-эндорфина в отделах мозга (гиппокампе, гипоталамусе, коре), как правило с возрастом снижается, а в гипофизе - увеличивается [25, 267]. Предполагают, что эти изменения связаны с возрастными особенностями формирования гипоталамо-гипофизарной системы.

У детей, подростков и взрослых обоих полов концентрация АКГТ в плазме крови практически одинакова, а концентация в-липотропина и в-эндорфина возрастает в препубертатном периоде и к началу полового созревания достигает величин, характерных для взрослых [181]. Т. к. эти пептиды происходят из единого предшественника - проопиомеланокортина [247], то избирательное изменение их концентрации может происходить только за счет изменения специфичности процессинга или изменения скорости деградации.

Пролактин обнаруживается в передней доле гипофиза крыс с Е17, его уровень не изменяется до Е21, резко увеличивается с Р1 до Р10. В сыворотке крови концентрация пролактина растет с Е17 до Е21 и снижается с Р1 до Р10 [275].

ВИП обнаруживается в мозге крыс на Е17, уровень его достигает минимума к Р20, а затем медленно повышается [254]. В заднем мозге крыс ВИП обнаруживается на Р4, его концентрация достигает максимума к Р18 [119, 159]. Его уровень в слюнных железах, как и вещества Р, волнообразно увеличивается в первые 8 недель развития крыс [158].

Нейропептид Y появляется в коре и подкорковых ядрах крыс на Е19, его уровень увеличивается к Р0 и далее не изменяется [162, 349]. В тазовом сплетении спинного мозга крыс этот пептид обнаруживается на Е18 [328].

Уровень нейротензина в гипоталамусе крыс возрастает от Р0 до Р19 [307].

Возрастные изменения уровня нейропептидов сильно зависят от пола животных, особенно в период полового созревания. Это связано с тем, что многие биологически активные пептиды вовлекаются в регуляцию уровня половых гормонов и в регуляцию функционирования половой системы [12, 94, 95]. Показано также, что изменение уровней половых гормонов вызывает изменение уровня различных нейропептидов, в том числе в-эндорфина, кортикотропин-подобного пептида, б-меланотропин-стимулирующего гормона, вещества Р [156, 346].

Обнаруженные к настоящему времени возрастные изменения уровня регуляторных пептидов, вероятно, связаны с изменениями в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации.

Активность Tyr-аминопептидазы в коре головного мозга котят с возрастом повышается, а Asp- аминопептидазы - снижается [259].

Активность пироглутамил-пептидазы І снижается с Р9 до Р20 в гипоталамусе, стриатуме, коре и гипофизе крыс [179, 259]. Активность фермента с Р20 до Р25 не изменяется. При этом в гипоталамо-гипофизарной оси наблюдаются достоверные отличия активности фермента у самцов и самок всех исследованных возрастов.

Уровень пролин-иминопептидазы в сыворотке крови детей старше 1 года уменьшается до 20 лет и несколько повышается позже [258]. Половых отличий при этом не обнаружено.

Активность диппептидиламинолпептидазы ІV и аминопептидазы М в мозге и изолированных микрососудах мозга во время снижается во время первых 8 недель постнатального развития. Активность аминопептидазы А снижается к Р14, а затем к 8 неделям возвращается к исходному уровню. При этом обнаружены половые отличия [129, 180].

Активность нейтральной эндопептидазы 24.11 в гипоталамусе крыс повышается с Р0 до Р7 и далее не изменяется, в коре больших полушарий она повышается с Р0 до Р30, а в мозжечке - снижается и далее не изменяется [278].

Активность металлоэндопептидазы 24.15 в коре повышается от Р0 до Р7, к Р90 возвращается к исходному уровню. В гипоталамусе и мозжечке уровень фермента постоянен в периоде Р0-Р30 и снижается к Р90 [278].

Уровень АПФ в стриатонигральном тракте и коре больших полушарий крыс возрастает от Р0 до Р20, а затем несколько снижается [326].

Активность КПН изменяется с возрастом. У эмбрионов крыс мРНК КПН экспрессируется как в нервной (таламус, гипоталамус, средний и продолговатый мозг, кортикальная пластинка и спинной мозг, а также периферические ганглии), так и в других тканях (сердце и первичные хрящи) [353]. В постнатальном периоде активность КПН у крыс обоего пола повышается, причем динамика изменения активности фермента в отделах мозга и периферических тканях различается [41, 142, 278]. Нужно отметить расхождения данных, опубликованных разными авторами, касающихся изменения активности КПН в одних и тех же отделах мозга в постнатальном периоде, что, вероятно, связано с различиями в экспериментальной методике.

Наибольшие различия (в частности, в гипоталамусе) отмечены непосредственно в период полового созревания. Начиная с 90-дневного возраста, достоверные половые различия в активности данного фермента обнаружены лишь в почках и половых железах. Особенно это выражено у 120-дневных крыс [101].

Имеются данные о возрастных изменениях активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в мозге и периферических тканях самцов крыс в период с рождения до 120-дневного возраста [41]. Причем в тканях с наибольшим содержанием данного фермента (гипофизе, семенниках, надпочечниках) отмечается снижение его активности с возрастом. Влияние возраста на активность фермента более выражено в мозге и тканях самцов, чем у самок [41, 101, 102]. Динамика возрастных изменений у животных разного пола в большинстве случаев совпадает.

Таким образом, приведенные сведения указывают на возможность вовлечения ферментов обмена физиологически активных пептидов в регуляцию онтогенетических изменений уровня этоих пептидов, а также в определение их половых различий. И представляется интересным исследование возрастной динамики ферментативной активности (в частности КПН и ФМСФ-КП) у крыс обоего пола, испытавших алкоголизацию в эмбриональном периоде.

* * *

Суммируя все выше изложенное, можно заключить:

В процессе онтогенеза в организме происходят значительные изменения обмена регуляторных пептидов и ферментов их обмена.

Важная роль в обмене пептидов принадлежит основным карбоксипептидазам. Они участвуют в конечной стадии процессинга неактивных предшественников пептидов и в начальных стадиях их инактивации, тем самым, контролируя уровень и соотношение биологически активных пептидов в организме.

Хроническая алкоголизация изменяет уровни и соотношение различных регуляторных пептидов (в первую очередь опиоидных пептидов, выполняющих важную роль в патогенезе алкоголизма) и активность ферментов их обмена.

Пренатальное воздействие этанола изменяет содержание регуляторных пептидов (в том числе и опиоидных) и формирует предрасположенность к развитию алкоголизма.

Все отмеченные изменения зависят от пола.

Представляет интерес сравнительное изучение активности основных карбоксипептидаз в тканях самок и самцов крыс, испытавших эмбриональное воздействие этанола, исследование активности этих ферментов при последующем постнатальном хроническом воздействии этанола. Эти данные могут иметь важное значение для выяснения биологической роли основных карбоксипептидаз в организме при алкоголизме, для понимания механизмов развития возрастных и половых отличий активности ферментов и уровней регуляторных пептидов при этом заболевании, механизмов формирования этанольной зависимости у потомков алкоголиков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

Опыты проводили на новорожденных, а также в возрасте 14, 28, 45, 120 суток после рождения, самках и самцах белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.

Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус и стриатум у всех крыс, а также четверохолмие, гиппокамп и большие полушария у животных в возрасте 120 суток.

Образцы выделенных тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl, в соотношении 1:100 (вес:объем). Гомогенаты использовали в качестве источников КПН и ФМСФ-КП.

В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (“Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Arg. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола.

Для исследования онтогенетических изменений активности основных карбоксипептидаз при внутриутробном хроническом воздействии этанола использовали две группы животных: пренатально алкоголизированную (Э) и контрольную (К). Животные пренатально алкоголизированной группы являлись потомством самок, получавших в течение всего периода беременности в качестве единственного источника жидкости 12 % раствор этанола, содержащий 5 % сахарозы; контрольной группы - потомством самок, получавших в этот период только 5 % раствор сахарозы.

Кроме того, для исследования активности данных ферментов при последующей постнатальной алкоголизации крыс, подвергнутых влиянию этанола в эмбриональном периоде, взрослых животных каждой группы разделили на две подгруппы: постнатально алкоголизированную и контрольную. Животные постнатально алкоголизированной подгруппы получали в течение 15 суток в качестве единственного источника жидкости 12% раствор этанола, содержащий 5% сахарозы; крысы контрольной подгруппы - 5% раствор сахарозы. Таким образом, было сформировано четыре подгруппы взрослых животных: контрольная (КК), пренатально алкоголизированная (ЭК), постнатально алкоголизированная (КЭ), пренатально и постнатально алкоголизированная (ЭЭ).

2.2.2. Метод определения активности ферментов

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.

Пробы преинкубировались 8 мин при 37^оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата - дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции - дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu - к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при _ex=360 нм и _em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].

2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»

Взрослых животных в возрасте 120 дней однократно тестировали по методу «открытое поле» [73]. Для этого животных помещали на ярко освещенную площадку (100х100 см), разделенную на квадраты (20х20 см). В течение 5 минут оценивали следующие поведенческие параметры:

· количество посещений периферических квадратов;

· количество посещений центральных квадратов;

· суммарную двигательную активность (общее количество посещении периферических и цетральных квадратов);

· суммарную вертикальную активность (количество стоек);

· общую активность (суммарную двигательную и вертикальную активность);

Рассчитывали отношение суммарной двигательной к суммарной вертикальной активности.

2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования

Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность возрастных подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл - временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов делали вывод о динамике изменения активности ферментов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола

3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность КПН в стриатуме, надпочечниках и семенниках самцов, в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках самок (табл. 1).

Табл. 1. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность КПН в тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера F_Ф).

Примечание: здесь и в табл. 2-8, 11, 12: n = 5ч8; достоверность критерия Фишера * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001.

При этом у самцов наблюдалось достоверное снижение активности КПН в стриатуме в возрасте Р0 и Р14 (рис. 1), в гипофизе в возрасте Р14, в надпочечниках в возрасте Р28 и Р120, в семенниках в Р0 и Р120 (рис. 2) по сравнению с интактными животными. У пренатально алкоголизированных самок наблюдалось достоверное снижение активности КПН в гипоталамусе в Р0, Р14, Р28, в стриатуме в Р14, Р45 (рис. 3), в гипофизе в Р0, в надпочечниках и яичниках в Р0 (рис. 4); увеличение активности в гипоталамусе (рис. 3) и в гипофизе в Р120 (рис. 4). Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности КПН (40% - 50%) наблюдались в стриатуме, гипофизе, половых железах животных обоего пола и гипоталамусе самок на ранних этапах постнатального развития, а так же в надпочечниках самцов в Р28 и Р120, в семенниках в Р120, в гипофизе самок в Р120 (113%).

По данным дисперсионного анализа активность КПН достоверно зависела от возраста во всех тканях животных, кроме гипоталамуса самок (табл. 3) и семенников самцов алкоголизированных групп, а также гипоталамуса самцов контрольной и алкоголизированной групп (табл. 2).

Табл. 2. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы возрастных групп).

Табл. 3. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самок крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы возрастных групп).

В стриатуме интактных самок (рис. 3) активность КПН значительно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 практически до исходного уровня. При пренатальной алкоголизации активность фермента постепенно повышалась от Р0 к Р28, а затем снижалась к Р45 - Р120 до уровня Р28.

В гипофизе интактных самок (рис. 4) активность КПН повышалась от Р0 к Р14 - Р45, а затем вновь снижалась до исходного уровня. У пренатально алкоголизированных самок активность фермента также повышалась от Р0 к Р14 - Р45, но не уменьшалась к Р120.

У интактных самок в надпочечниках (рис. 4) активность фермента существенно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 до исходного уровня; в яичниках (рис. 4) активность КПН значительно снижалась от максимального уровня в Р0 - Р14 к Р28 - Р120. У алкоголизированных самок возрастная динамика изменения активности фермента в надпочечниках и яичниках была сходна с интактными крысами.

Таким образом, у пренатально алкоголизированных животных отмечалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН.

Активность КПН зависела от пола в гипофизе интактных животных, в гипоталамусе и надпочечниках алкоголизированных животных (табл. 4). Ферментативная активность зависела от взаимодействия пола и возраста во всех тканях контрольных животных, кроме надпочечников, а также в гипофизе и надпочечниках алкоголизированных крыс (табл. 4). Влияние пола у алкоголизированных животных меньше зависело от возраста, чем у контрольных.

Табл. 4. Дисперсионный анализ влияния пола и взаимодействия пола и возраста на активность КПН (значения критерия Фишера: F_Ф1- влияние пола, F_Ф2 - взаимодействие влияния пола и возраста).

У контрольных самок в гипоталамусе, по сравнению с самцами, активность КПН была выше в Р14, ниже в Р120 и одинаковой в остальные возрастные периоды. У пренатально алкоголизированных самок - ниже в Р28 и не отличалась в других возрастных группах от контрольных самцов (рис. 1, 3).

В стриатуме контрольных самок активность КПН была выше, чем у самцов в Р14 и Р45, но не отличалась у алкоголизированных крыс в течение всего исследуемого периода (рис. 1, 3).

У интактных самок, по сравнению с самцами, активность КПН в гипофизе была одинаковой в Р0, выше в Р14 и ниже в Р28 - Р120; у пренатально алкоголизированных - ниже в Р0 - Р14, не отличалась в Р28 - Р45 и выше в Р120.

В надпочечниках интактных самок ферментативная активность была одинаковой в Р0, Р45 и Р120, выше в Р14 и ниже в Р28 по сравнению с интактными самцами; у алкоголизированных самок - ниже в Р0, выше в Р14 и Р28, одинаковой в Р45 и Р120 (рис. 2, 4).

В яичниках контрольных самок активность исследуемого фермента была ниже в Р45 и Р120 по сравнению с семенниками самцов. У алкоголизированных животных обоего пола активность КПН в половых железах была одинаковой с Р0 по Р120 (рис. 1-2).

Т. е., при внутриутробном воздействии этанола произошло изменение полового соотношения активности КПН. В некоторых случаях (в гипоталамусе в Р14 и Р120, в стриатуме в Р14 и Р45, в гипофизе в Р28 и Р45, в половых железах в Р45 и Р120) активность КПН стала одинаковой у животных разного пола, в других (в гипоталамусе в Р28 и в гипофизе в Р0) у самок активность КПН стала ниже, чем у самцов, а в гипофизе в Р120 и в надпочечниках в Р28 половые отличия сохранились, но соотношение активности стало противоположным.

Таким образом, полученные результаты показывают, что у контрольных животных активность КПН изменялась с возрастом практически во всех тканях. Причем наибольшая ферментативная активность отмечалась у самцов в Р28 во всех тканях (кроме семенников), в семенниках в Р120, а у самок в Р14 во всех тканях. Это согласуется с литературными данными о наиболее существенных изменениях у самок крыс в инфантильном периоде (с Р8 по Р21), у самцов - в ювенильном (с Р21 по Р32) и препубертатном (после Р32) периодах [12]. Это подтверждает ранее высказанное предположение о вовлечение КПН в процесс пубертации и формирование половых отличий [88, 101].

Возрастная динамика активности КПН в отделах мозга отличалась от таковой в периферических тканях. Вероятно, это объясняется вовлечением изучаемого фермента в метаболизм разных пептидов в мозге и в периферических тканях [41, 124, 174].

При влиянии пренатальной алкоголизации наблюдалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН. Причем у самок наиболее существенно она нарушалась в гипоталамусе и стриатуме, а у самцов - в надпочечниках и семенниках. Возможно, пренатальная алкоголизация, изменяя уровень активности КПН - одного из ферментов обмена биологически активных пептидов, у самок нарушала формирование и функционирование отделов ЦНС, а у самцов - периферических звеньев ГГНС и ГГГС [109, 114, 177, 182, 190, 191, 208, 269, 280, 281, 282, 291, 313].

Изменение активности КПН в тканях эмбрионально алкоголизированных животных в разные возрастные периоды происходило преимущественно в сторону снижения. И только в гипофизе и гипоталамусе самок в Р120 активность КПН увеличилась. Причем в гипоталамусе (отделе, играющем важнейшую роль в патогенезе алкоголизма) самок наблюдались отличия практически в течение всего периода онтогенеза. Тогда как у самцов в этом отделе изменения активности КПН с Р0 до Р120 не выявлены.

Внутриутробное воздействие этанола вызвало нарушение половых отличий активности данного фермента, что, вероятно, связано с нарушением процесса пубертации и формирования половых отличий у потомков алкоголиков [109, 138, 177, 239, 264, 265, 271, 280, 281].

3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность ФМСФ-КП в яичниках самок (табл. 5).

Табл. 5. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность ФМСФ-КП тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера F_Ф)

При этом у самцов (рис. 5, 6) наблюдалось достоверное снижение активности ФМСФ-КП в стриатуме в Р14 и Р120, в гипофизе и семенниках в Р14.

У пренатально алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была ниже во всех исследованных тканях в Р14 и в яичниках в Р120, и была выше в гипофизе в Р120 (рис. 7, 8) по сравнению с интактными самками. Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности ФМСФ-КП (23% - 48%) наблюдались в гипофизе, стриатуме, половых железах самцов и во всех тканях самок на ранних этапах постнатального развития, а также в яичниках самок в Р120.

По данным дисперсионного анализа возраст достоверно влиял на ФМСФ-КП во всех отделах и тканях животных обоего пола контрольной и алкоголизированной групп, кроме гипоталамуса и яичников алкоголизированных самок (табл. 6, 7).

Табл. 6. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самцов крыс (критерий Фишера F_Ф, баллы возрастных подгрупп).

При этом наблюдалась следующая возрастная динамика активности ФМСФ-КП. В гипоталамусе самцов активность ФМСФ-КП повышалась к Р14 у интактных и к Р14 - Р28 у алкоголизированных крыс, и значительно снижалась к Р120 у обеих групп (рис. 5).

В стриатуме контрольных самцов активность фермента плавно уменьшалась от максимального значения в Р0 - Р14 к Р120; у алкоголизированных самцов активность ФМСФ-КП была наибольшей в Р28 и наименьшей в Р120 (рис. 5).

В гипофизе контрольных самцов активность ФМСФ-КП повышалась от Р0 до максимального значения к Р14, затем снижалась к Р28, вновь, но в меньшей степени, повышалась к Р45, а к Р120 стала ниже исходного уровня. В гипофизе алкоголизированных самцов динамика изменения ферментативной активности практически не отличалась от интактных животных (рис. 6).

Табл. 7. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самок крыс (критерий Фишера F_Ф, баллы возрастных подгрупп).