МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ імені П.Л. ШУПИКА

Гудзенко Андрій Вікторович

УДК 582.923.1 +615.451

фармакогностичне дослідження надземної частини кульбаби лікарської (taraxacum officinale WIGG.) та розробка способів аналізу біологічно активних речовин

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі „Інститут фармакології та токсикології” АМН України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Цуркан Олександр Олександрович,

Державна установа „Інститут фармакології та токсикології” АМН України, завідувач Державної лабораторії з контролю якості лікарських засобів

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, старший

науковий співробітник

Коновалова Олена Юріївна,

Медичний інститут Української асоціації

народної медицини, завідуюча кафедрою

фармацевтичної хімії та фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

ДОЛЯ ВІКТОР СЕМЕНОВИЧ

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри фармакогнозії

Захист відбудеться „__23_” _травня___ 2008 р. о _11.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий „_17__” _квітня__ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.Б. Пилипчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук та створення нових лікарських засобів рослинного походження, розробка методик контролю їх якості з застосуванням сучасних методів фармацевтичного аналізу, а також організація їх промислового виробництва - важливе завдання вітчизняної фармації. Особлива увага надається рослинам з багатовіковим досвідом використання в народній медицині, до яких належить кульбаба лікарська (Taraxacum oficinale Wigg.).

На українському фармацевтичному ринку зареєстровані та широко використовуються багатокомпонентні препарати, що містять як підземну частину (Гепатофіт, Детоксифіт, Тоніфіт, Нефрофіт), так і надземну частину кульбаби лікарської (Тонзилгон Н та деякі гомеопатичні засоби). Застосовують їх при гострих та хронічних захворюваннях дихальних шляхів, при захворюваннях сечовивідних шляхів, сечо-камяній хворобі, хронічному холециститі, дискінезії жовчних шляхів, жовчного міхура тощо.

Серед ліків вітчизняного виробництва на даний час відсутні препарати, виготовлені з надземної частини кульбаби лікарської, незважаючи на широке розповсюдження цієї рослини по всій території України.

Методи ідентифікації та кількісного визначення біологічно активних речовин (БАР) кульбаби лікарської розроблені недостатньо. Тому розробка методів дослідження БАР і впровадження в медичну практику нової лікарської рослинної сировини, яка може бути замінником офіцинальної сировини, є актуальним напрямком фармакогностичних досліджень. Недостатній рівень досліджень щодо розробки методів аналізу та фармакологічних властивостей надземної частини (листя, квітки) кульбаби лікарської, а також висока доступність сировини зумовлюють актуальність дисертаційної роботи.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії „Фармація” МОЗ та АМН України і є фрагментом науково-дослідних робіт Державної установи „Інститут фармакології та токсикології” АМН України: „Розробка сучасних методик ідентифікації та аналізу нових похідних пінацедилу та рослинних фізіологічно-активних речовин - флавоноїдів, сапонінів та серцевих глікозидів, які виявляють кардіотропну дію” (номер державної реєстрації 0100U000296) та „Розроблення методик аналізу окремих лікарських рослин ноотропної дії та їх сумішей” (номер державної реєстрації 0106U000870).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є фармакогностичне дослідження надземної частини кульбаби лікарської для визначення показників та контролю якості сировини і потенційних лікарських засобів за вмістом біологічно активних речовин з використанням сучасних методів аналізу.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- провести фітохімічне дослідження сировини надземної частини кульбаби лікарської;

- виділити та ідентифікувати біологічно активні речовини з листя і квіток кульбаби лікарської;

- розробити методики аналізу біологічно активних речовин в сировині, в моно- та багатокомпонентних препаратах з надземної частини кульбаби лікарської;

- розробити нові методики аналізу біологічно активних речовин в сировині, в моно- та багатокомпонентних препаратах підземної частини кульбаби лікарської;

- розробити спосіб одержання та провести стандартизацію екстрактів з надземної частини кульбаби лікарської;

- вивчити фармакологічні властивості екстрактів з сировини надземної частини рослини та визначити можливість створення лікарських засобів з листя та квіток кульбаби лікарської;

- розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на сировину листя, квіток і коренів кульбаби лікарської та на їх перспективні фітокомпозиції.

Обєкти дослідження: листя, квітки та корені кульбаби лікарської, водні та водно-спиртові екстракти, багатокомпонентні фітокомпозиції, індивідуальні біологічно активні речовини.

Предмет дослідження: виділення, ідентифікація біологічно активних речовин надземної частини кульбаби лікарської, розробка методик аналізу біологічно активних речовин підземної та надземної частин кульбаби лікарської, можливості аналізу окремих БАР в багатокомпонентних сумішах, створення нових потенційних фітозасобів.

Методи дослідження. Біологічно активні речовини вивчали з використанням фармакопейних методів аналізу, зокрема, використовували тонкошарову (ТШХ), паперову хроматографію (ПХ), методи високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), газо-рідинної хроматографії (ГРХ), ультрафіолетову (УФ) та інфрачервону (ІЧ) спектрофотометрію. Для виділення БАР з рослинної сировини використовували колонкову хроматографію на поліамідному сорбенті. Хімічну будову виділених речовин встановлювали методом УФ-спектрального аналізу з використанням спектрофотометрів типу СФ-4, Hewlett Packard 8452A та ІЧ-спектрального аналізу за допомогою спектрофотометрів Perkin Elmer Spectrum BX та Perkin Elmer 325. ВЕРХ аналіз проводився на хроматографі Perkin Elmer, Ser200, обладнаному УФ-детектором. ГРХ-аналіз проводився на газовому хроматографі Hewlett Packard 5890 сер. 2+. Фармакологічні дослідження проводились in vivo та in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне вивчення якісного складу та кількісного вмісту БАР листя та квіток кульбаби лікарської.

З листя кульбаби лікарської вперше виділено лютеолін-4-О-в-D-глюкопіранозид та п-кумарову кислоту, вперше ідентифіковано 4 цукри та 8 жирних кислот. Всього в листі кульбаби лікарської ідентифіковано 35 біологічно активних речовин: 4 гідроксикоричні кислоти, 3 флавоноїди, 12 амінокислот, 9 жирних кислот, 4 цукри, тритерпеноїд, стерин та кумарин.

В квітках кульбаби лікарської вперше ідентифіковано L-рамнозу та 4 жирні кислоти. Всього в квітках кульбаби лікарської ідентифіковано 45 біологічно активних речовин: 4 гідроксикоричні кислоти, 3 флавоноїди, 13 амінокислот, 14 жирних кислот, 5 цукрів, 3 токофероли, тритерпеноїд, стерин та кумарин.

Вперше досліджено вміст біологічно активних речовин у коренях, листі та квітках кульбаби лікарської в залежності від фази вегетації і місця зростання рослини з використанням сучасних аналітичних методів.

Вперше розроблені методики аналізу окремих БАР кульбаби лікарської в присутності компонентів інших рослин.

Розроблені методики стандартизації рослинної сировини, перспективних та існуючих лікарських препаратів (ЛП) надземної та підземної частин кульбаби лікарської з використанням сучасних аналітичних методів.

За розробленими методиками проведено аналіз ЛП, до складу яких входить кульбаба лікарська.

Опрацьовано оптимальні умови одержання екстрактів з листя та квіток кульбаби лікарської. Встановлено, що ці екстракти є нетоксичними і виявляють антиоксидантну, геномозахисну та протизапальну активність.

Наукова новизна отриманих результатів підтверджена патентами України на корисну модель №16657 і №26668 та позитивним рішення на видачу патенту України на корисну модель (заявка №u200712178 від 05.11.2007).

Практичне значення одержаних результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість використання квіток та листя кульбаби лікарської як лікарської рослинної сировини.

Розроблено проекти АНД “Кульбаби лікарської листя”, „Кульбаби лікарської квітки”, „Кульбаби лікарської корені”, „Фітокомпозиція Кардіосед”.

Розроблені методики аналізу БАР кульбаби лікарської запропоновані для удосконалення методів аналізу препаратів кульбаби лікарської.

Розроблено і затверджено аналітичну нормативну документацію вхідного контролю АНД ВК-42-2008 „Листя кульбаби лікарської”, згідно з якоїю контролюється якість сировини при виробництві рослинних препаратів на підприємстві ТОВ „АСТРАФАРМ” (м. Київ).

Матеріали роботи впроваджено в навчальний процес та науково-дослідну роботу кафедри фармакогнозії Національного фармацевтичного університету, кафедри хімії фармацевтичного факультету Івано-Франківського Державного університету, кафедри фармакогнозії та фармацевтичної хімії Медичного інституту Української асоціації народної медицини, кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету, сектору хімії та технології фенольних препаратів ДП „Державний науковий центр лікарських засобів” (м. Харків).

Особистий внесок здобувача. У наукових працях, опублікованих самостійно та зі співавторами особисто автором:

- проведений аналіз літературних даних щодо ботанічної характеристики, розповсюдження кульбаби лікарської, хімічного складу і використання кульбаби лікарської в медицині;

- встановлено основні групи БАР в листі та квітках кульбаби лікарської, проведено їх кількісний аналіз в сировині по фазах вегетації та в залежності від місць зростання;

- ідентифіковано 48 БАР в листі та квітках кульбаби лікарської;

- розроблено методики стандартизації компонентів надземної та підземної частин кульбаби лікарської для існуючих та потенційних препаратів, виготовлених на їх основі, за вмістом БАР з застосуванням сучасних аналітичних методів;

- розроблено способи одержання екстрактів надземної частини кульбаби лікарської та досліджена їх фармакологічна активність.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено на III Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003), науково-практичній конференції з міжнародною участю „Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), VI Національному зїзді фармацевтів України (Харків, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 6 статей (5 із них у наукових фахових виданнях), 2 деклараційних патенти на корисну модель, 7 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, пяти розділів експериментальних досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури та 14 додатків. Дисертація викладена на 291 сторінці машинописного тексту. Обсяг основного тексту 148 сторінок. Дисертаційна робота ілюстрована 41 рисунком і 44 таблицями. Список використаних джерел містить 183 найменування, з них 70 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Кульбаба лікарська: ботанічна характеристика, хімічний склад, застосування в медицині (огляд літератури)

В розділі проаналізовані та узагальнені дані первинних джерел з ботанічної характеристики, ареалу розповсюдження, сучасного стану вивчення хімічного складу, використання в науковій та народній медицині надземної та підземної частин кульбаби лікарської. Представлена номенклатура лікарських засобів (ЛЗ), що містять у своєму складі кульбабу лікарську та описані сучасні методи аналізу біологічно активних речовин, що входять до складу кульбаби лікарської.

Дослідження хімічного складу та ідентифікація біологічно активних речовин з надземної частини кульбаби лікарської

Обєктами дослідження були листя та квітки кульбаби лікарської (Taraxacum officinale Wigg.), зібрані в фазу масового цвітіння рослини.

В результаті хімічного скринінгу листя та квіток кульбаби лікарської, який проводився загальноприйнятими методами (якісні реакції, ПХ, ТШХ, ВЕРХ, ГРХ), встановлено наявність таких груп БАР, як гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, кумарини, тритерпеноїди, полісахариди, амінокислоти, стерини, жирні кислоти, каротиноїди, токофероли та хлорофіли.

На основі результатів аналізу фізико-хімічних властивостей (даних УФ-, ІЧ-спектрального аналізів, хроматографії, порівняння з вірогідними зразками), даних ВЕРХ та ГРХ хроматографування, встановлена структура 48 речовин. Виділення БАР з листя та квіток кульбаби лікарської проводили за допомогою рідинно-рідинного фракціювання, хроматографії на поліаміді, рехроматографії та дробної кристалізації. Фізико-хімічні властивості речовин, виділених із листя та квіток кульбаби лікарської, представлені в табл. 1.

Флавоноїди. Флавоноїдну природу речовин Ф1, ФГ1, ФГ2, ФГ3 доводили на основі результатів фізико-хімічних досліджень: якісними реакціями, хроматографічним аналізом, даними спектрального аналізу, продуктами гідролізу. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3500-2900 см^-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см^-1 (карбонільна група г-пірону), 1640-1450 см^-1 (валентні коливання ароматичних кілець).

За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, флуоресценції в УФ-світлі, результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовину Ф1 віднесли до агліконів, речовини ФГ1, ФГ2, ФГ3 до глікозидів.

Речовину агліконової природи Ф1 було ідентифіковано як 5,7,3,4-тетрагідроксифлавон (лютеолін).

Монозиди флавоноїдів. В результаті кислотного гідролізу речовин ФГ1, ФГ3 утворювались еквімолярні кількості аглікону, який був ідентифікований як лютеолін, та цукрового компоненту, який хроматографічно ототожнили як глюкозу. З використанням специфічних реакцій та диференційної УФ-спектрофотометрії встановили місце приєднання глюкозидних фрагментів (для речовини ФГ1 біля С-7, для речовини ФГ3 біля С-4). В ІЧ-спектрах речовин виявляється смуга при 885см^-1, що вказує на в-глікозидний звязок, три смуги при 1100 - 1010 см^-1 характерні для піранозного окисного циклу цукрових залишків. Отже, речовину ФГ1 ідентифікували як лютеолін-7-О-в-D-глюкопіранозид (цинарозид), речовину ФГ3 - як лютеолін-4-О-в-D-глюкопіранозид.

Диглюкозид флавоноїду. В результаті кислотного гідролізу речовини ФГ2 утворювався аглікон лютеолін та цукрові компоненти, які хроматографічно ототожнили як глюкозу та арабінозу (молярне співвідношення аглікон : цукровий залишок = 1:2). В результаті ступінчатого гідролізу речовини спочатку утворювались цинарозид та арабіноза, потім лютеолін та глюкоза. За допомогою якісних реакцій, УФ- та ІЧ-спектральних характеристик у порівнянні з достовірним стандартом, речовину ФГ2 ідентифікували як лютеолін-7-О-в-D-глюкопіранозил-6-б-L-арабінозид.

Гідроксикоричні кислоти. Речовини ОК1, ОК2, ОК3, ОК4 на хроматографічному папері давали позитивні реакції на фенольний гідроксил (з заліза (ІІІ) хлоридом, діазотованою сульфаніловою кислотою). Кислотні властивості виявлені на підставі утворення синіх плям на ПХ з бромтимоловим синім. При обробці хроматограм реактивом барбітурової кислоти пляма речовини ОК1 давала блакитне забарвлення, що свідчить про наявність у її складі хінної кислоти.

На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками (температура плавлення, флуоресценція в УФ-світлі, лужна деструкція,

Таблиця 1

Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених та ідентифікованих в листі та квітках кульбаби лікарської

дані УФ- та ІЧ-спектрів, хроматографічна поведінка (ПХ, ТШХ, ВЕРХ) речовини ОК1, ОК2, ОК3 та ОК4 відповідно ідентифіковані з 5-О-кофеїл-D-хінною (хлорогеновою), 3,4-дигідроксикоричною (кавовою), 4-гідроксикоричною (п-кумаровою) та 2,3-дикофеїлвинною (цикорієвою) кислотами.

З листя кульбаби лікарської вперше виділено лютеолін-4-О-в-D-глюкопіранозид та п-кумарову кислоту, вперше ідентифіковано 4 цукри та 8 жирних кислот. В квітках кульбаби лікарської вперше ідентифікована L-рамноза та 4 жирні кислоти.

Отримані результати дозволяють підібрати та адаптувати методики для кількісного визначення флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, полісахаридів, амінокислот, токоферолів в листі та квітках кульбаби лікарської, вибрати стандарти для перерахунку.

Ідентифіковані групи БАР та індивідуальні речовини, виділені з квіток та листя кульбаби лікарської, дозволяють припустити, що вказана сировина може мати протизапальну, антиоксидантну та геномозахисну активність.

Визначення кількісного вмісту БАР різних груп в сировині та препаратах кульбаби лікарської

З метою стандартизації сировини листя, квіток та коренів кульбаби лікарської та порівняльного аналізу вмісту БАР в надземній та підземній частинах кульбаби лікарської були розроблені методики аналізу та проведено визначення вмісту амінокислот, жирних кислот, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, полісахаридів, токоферолів, каротиноїдів, хлорофілів та мікроелементів.

Із застосуванням методу ВЕРХ розроблено методику якісного та кількісного аналізу амінокислот в сировині кульбаби лікарської. В квітках та коренях ідентифіковано 13 амінокислот, в листі - 12 амінокислот. Найбільший вміст амінокислот знайдено в сировині квіток кульбаби лікарської - 1,90 %, менший вміст в сировині листя - 1,40 %, найменший вміст амінокислот знайдено в сировині коренів кульбаби лікарської - 1,22 %. Дані щодо вмісту амінокислот в сировині кульбаби лікарської представлені в табл. 2.

За допомогою методу ГРХ розроблена методика аналізу жирних кислот в сировині кульбаби лікарської. Встановлено, що в коренях, листі та квітках кульбаби лікарської переважають поліненасичені жирні кислоти. В листі кульбаби лікарської частка поліненасичених жирних кислот становить 68,88 %, в коренях - 65,42 %, в квітках кульбаби лікарської - 62,09 %. Дані щодо вмісту жирних кислот в сировині кульбаби лікарської представлені в табл. 3.

Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначено кількісний вміст 9 макро- та мікроелементів в листі, квітках та коренях кульбаби лікарської. Встановлено, що найбільший вміст в надземній частині кульбаби лікарської мають марганець, залізо та цинк. При цьому слід зазначити, що вміст цинку та марганцю більший в сировині листя кульбаби лікарської, вміст же заліза більший в сировині квіток кульбаби лікарської. В коренях кульбаби найбільший вміст мають магній, залізо та цинк, причому вміст магнію на порядок більший, ніж в надземній частині кульбаби лікарської.

Досліджені ліпофільні екстракти квіток та листя кульбаби лікарської. Встановлено, що хлорофілу міститься більше в ліпофільному екстракті листя

Таблиця 2

Кількісний вміст амінокислот в сировині кульбаби лікарської

Таблиця 3

Результати визначення вмісту жирних кислот в сировині кульбаби лікарської

кульбаби лікарської - 52,5±1,3 мг/г, тоді як в екстракті квіток - 10,4±0,8 мг/г. Токоферолів міститься більше в екстракті листя - 0,856±0,05 мг/г, проти 0,535±0,008 мг/г в екстракті квіток. Вміст каротиноїдів становив в екстракті квіток кульбаби лікарської - 4,33±0,30 мг/г, в екстракті листя - 4,47±0,20 мг/г.

За допомогою методів УФ-спектрофотометрії та ВЕРХ розроблені методики аналізу суми оксикоричних кислот та цикорієвої кислоти в сировині та препаратах кульбаби лікарської.

З використанням розробленої нами УФ-спектрофотометричної методики встановлено, що найбільший вміст суми оксикоричних кислот знаходиться в сировині листя кульбаби лікарської, менший - в квітках, найменший - в коренях кульбаби лікарської. Досліджено коливання вмісту суми оксикоричних кислот в сировині, зібраній у різні роки в різних регіонах України (табл. 4). Встановлено, що вміст оксикоричних кислот у сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 3,01±0,13 % до 3,81±0,18 %, вміст оксикоричних кислот в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 1,920±0,101 % до 2,72±0,11 %, вміст оксикоричних кислот в сировині коренів коливається в межах від 0,98±0,07 % до 1,11±0,08 %.

З використанням розробленої ВЕРХ-методики встановлено, що найбільший вміст цикорієвої кислоти знаходиться в сировині листя кульбаби лікарської, менший - в квітках, найменший - в коренях кульбаби лікарської. Хроматограми цикорієвої кислоти та екстрактів кульбаби лікарської представлені на рис. 1-4. Досліджено як коливається вміст цикорієвої кислоти в сировині, зібраній в різні роки в різних регіонах України (табл. 4). Встановлено, що вміст цикорієвої кислоти в сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 1,21±0,07 % до 1,53±0,05 %, вміст цикорієвої кислоти в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 0,52±0,03 % до 0,066±0,02 %, вміст цикорієвої кислоти в сировині коренів коливається в межах від 0,30±0,02 % до 0,32±0,02 %.

Таблиця 4

Вміст суми оксикоричних кислот та цикорієвої кислоти в сировині кульбаби лікарської, зібраної в різних регіонах України

хв.

Рис. 1. Хроматограма розчину цикорієвої кислоти.

хв.

Рис. 2. Хроматограма екстракту листя кульбаби лікарської.

хв.

Рис.3. Хроматограма екстракту квіток кульбаби лікарської.

хв.

Рис. 4. Хроматограма екстракту коренів кульбаби лікарської.

Із застосуванням методу УФ-спектрофотометрії розроблено методику аналізу суми флавоноїдів в сировині кульбаби лікарської в перерахунку на лютеолін. Проаналізовано сировину листя та квіток кульбаби лікарської, зібраної в різних регіонах України (табл. 5). Встановлено, що вміст флавоноїдів в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 0,4913±0,0360 % до 0,7106±0,0740 %.

Вміст суми флавоноїдів в сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 0,1821±0,0135 % до 0,2235±0,0183 %.

Таблиця 5

Вміст суми флавоноїдів та вільного лютеоліну в сировині квіток кульбаби лікарської, зібраної в різних областях України