Фармакогностичне вивчення розторопші плямистої - автореферат

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВЯ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Болоховець Ганна Сергіївна

УДК:615.32:582.998:615.244

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ РОЗТОРОПШІ ПЛЯМИСТОЇ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоровя України

Науковий керівник:доктор фармацевтичних наук, професор

КИСЛИЧЕНКО ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри хімії природних сполук

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри ботаніки;

кандидат фармацевтичних наук

ТЕРНИНКО ІННА ІВАНІВНА

Луганський Державний медичний університет,

доцент кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться "_20_" ____червня___ 2008 року о ____12____годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий "_16___" __травня_ 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

професор Л.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У фармацевтичній практиці біологічно активні речовини, отримані з лікарських рослин, мають велике значення, оскільки є сировиною для виробництва лікарських засобів фармацевтичною промисловістю. Одним з важливих завдань фармації є розробка нових лікарських засобів. Пошук рослин з достатньою сировинною базою, які можуть доповнити номенклатуру офіцинальних видів, раціональне та комплексне використання сировини, а також створення на їх основі нових лікарських засобів - актуальне завдання сучасної фармації.

До таких рослин належить розторопша плямиста - Silybum marianum, родини Asteraceae, плоди якої широко використовуються для виробництва лікарських препаратів та спеціальних харчових продуктів-дієтичних добавок. Відходом виробництва препаратів є корені, трава та олія з плодів розторопші, які містять значну кількість біологічно активних речовин (БАР). На практиці потенціал БАР та природний ресурс вказаної сировини використовується недостатньо. Інтерес до коренів, трави та олії з плодів розторопші, як вторинного виду сировини, обумовлений рядом факторів, серед яких: наявність комплексу БАР, якісний склад і кількісний вміст якого дозволяє розглядати ці сировинні джерела приоритетними для виробництва лікарських та косметичних засобів, а також продуктів спеціального призначення. Потенційні обєми коренів, трави та олії дозволяють класифікувати їх як промислову багатотонажну сировину. Зростаючі обєми коренів, трави та олії (як відходів виробництва), які щорічно накопичуються при переробці, можуть складати серйозну загрозу для довкілля і тому потребують розробки та впровадження ефективних шляхів їх утилізації.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії „Фармація” МОЗ України і є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Національного фармацевтичного університету “Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження” (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення різних груп БАР вегетативних та генеративних органів розторопші плямистої та визначення можливості створення лікарських засобів на їх основі.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

провести інформаційний пошук, критичний аналіз сучасного стану досліджень за темою дисертаційної роботи;

провести попередні фітохімічні дослідження якісного складу коренів, трави та плодів розторопші плямистої;

визначити кількісний вміст основних груп БАР в коренях, траві та плодах розторопші плямистої;

отримати біологічно активні субстанції, визначити їх хімічний склад та фармакологічну дію;

виділити в індивідуальному стані БАР і встановити їх структуру;

розробити спосіб стандартизації олії з плодів розторопші плямистої;

встановити основні анатомо-діагностичні ознаки коренів, трави та плодів розторопші плямистої;

провести стандартизацію сировини, олії з плодів та збору з протидіабетичною активністю та розробити проекти АНД;

підтвердити можливість створення нових лікарських засобів з сировини, що вивчалася, шляхом вивчення фармакологічної активності отриманих субстанцій.

Обєкти дослідження: корені, трава, плоди, олія з плодів розторопші плямистої, цукрознижуючий збір та виділені з них БАР: вільні і зв`язані цукри, амінокислоти, макро- та мікроелементи, полісахариди, пектинові речовини, органічні кислоти, арбутин, гідроксикоричні кислоти, флаволігнани, флавоноїди, дубильні та ліпофільні речовини.

Предмет дослідження: виявлення, виділення, ідентифікація БАР з коренів, трави, плодів та олії з плодів розторопші плямистої, створення на їх основі нових лікарських засобів, вивчення їх фармакологічної активності.

Методи дослідження. Якісний склад та кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, а також використовували тонкошарову (ТШХ), паперову (ПХ) та газорідинну хроматографію (ГРХ). Ліпофільні комплекси досліджували за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру. Для розділення БАР використовували колонкову хроматографію на поліаміді та силікагелі, а також препаративну хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбенту. Хімічну будову виділених сполук встановлювали за допомогою УФ-, ІЧ-, ПМР-спектрів, температури плавлення та їх хімічних перетворень. Анатомічну будову трави, коренів та плодів вивчали на препаратах з поверхні та поперечних зрізах. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено системне фітохімічне вивчення БАР коренів, трави та плодів розторопші, що культивується на території України.

Встановлено в них наявність та кількісний вміст вуглеводів, амінокислот, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, флаволігнанів, речовин лактонної природи, дубильних речовин, кислоти оксалатної, хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот, макро- та мікроелементів.

З коренів, трави та плодів розторопші плямистої в індивідуальному стані виділено 26 речовин: 1 простий фенол, 2 гідроксикоричні кислоти, 15 флавоноїдів, 4 флаволігнани, 1 органічна кислота, 2 сесквітерпенових лактони та 1 стероїд. З них - 7 виділено вперше. Визначено наявність 15 амінокислот, 22 макро- і мікроелементів, ідентифіковано 11 вільних жирних кислот.

Розроблено спосіб одержання збору “Фітоглюнор”, для якого вивчена цукрознижуюча активність. Новизна досліджень підтверджена та захищена деклараційним патентом України на винахід № 7518.

Вперше встановлено анатомічні ознаки коренів та трави розторопші, які були використані для діагностики лікарської рослинної сировини та створення проектів АНД на неї. АНД на “Плоди розторопші” може використовуватися фармацевтичною промисловістю замість ДСТУ № 64-4-30-81 (Плод расторопши пятнистой), оскільки відповідає сучасним вимогам до НТД.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб одержання цукрознижуючого збору “Фітоглюнор”. Розроблені проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на „Корені розторопші плямистої”, „Траву розторопші плямистої”, „Плоди розторопші плямистої”, „Олію з плодів розторопші” та „Цукрознижуючий збір ” Фітоглюнор”. Технологію отримання збору “Фітоглюнор” апробовано в умовах виробництва ЧП “Кирієнко”; “Плоди розторопші подрібнені” виробляються ЧП “Кирієнко” ( згідно з ТУ У 01.1-2680903989-001-2004 “Плоди розторопші плямистої (подрібені)) ; Олія з плодів розторопші - ТОВ “ФК “Здоровя” ( згідно з ТУ У 15.4-31437750-001-2002 “Олія розторопші торгової марки “Здоровя”).

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено:

- інформаційний пошук за темою дисертаційної роботи, синтез і аналіз отриманих даних, аналіз сучасних досліджень за проблематикою, що вивчалася, результати яких стали підґрунтям до вибору обєктів дослідження; - встановлено наявність і визначено кількісний вміст полісахаридів (та їх фракційний склад), амінокислот, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, жирних кислот, хлорофілів, каротиноїдів, кислоти оксалатної, флаволігнанів, речовин лактонної природи, бетаїну, інуліну, макро- та мікроелементів; - виділено та ідентифіковано 26 сполук;

- вивчено анатомічну будову трави, коренів та плодів розторопші плямистої; - розроблено проекти АНД на сировину „Трава розторопші плямистої”, „Корені розторопші плямистої”, “Плоди розторопші плямистої”, ”Олія з плодів розторопші плямистої” та ”„Цукрознижуючий збір ” Фітоглюнор”.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено та обговорено на Всеукраїнському науково-практичному семінарі „Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків, 2004), науково-практичній конференції „Актуальные проблемы образования, науки и производства в фармации” (Ташкент, 2005), VI Національному з`їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі „Ліки та життя”, (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових робіт, в тому числі 6 статей у фахових наукових виданнях, 10 тез доповідей, 1 патент України, 1 реєстр галузевих нововведень.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, чотирьох розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та 17 додатків. Дисертацію викладено на 212 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 34 рисунками та 33 таблицями. Обсяг основного тексту - 140 сторінок. Список літератури включає 238 джерел, з них 203 кирилицею та 35 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Аналіз даних літератури показав, що розторопша є перспективною рослиною для отримання біологічно активних речовин для застосування у фармацевтичній промисловості. Але хімічний склад генеративних та вегетативних органів вивчено не досить повно: мало вивчені трава та корені розторопші. Тому актуальним є вивчення хімічного складу зазначених видів сировини розторопші, розробка аналітичної нормативної документації для стандартизації цієї сировини, що дасть змогу створення лікувально-профілактичних засобів на її основі.

Дослідження хімічного складу вегетативних та генеративних органів розторопші з виділенням і встановленням структури біологічно активних сполук

За допомогою якісних реакцій та хроматографії з використанням водних, водно-спиртових, хлороформних, етилацетатних, бутанольних екстрактів у траві, коренях та плодах розторопші встановлено наявність вуглеводів, амінокислот, пектинових та дубильних речовин, органічних та гідроксикоричних кислот, кумаринів, флавоноїдів, сапонінів, бетаїну, флаволігнанів, речовин лактонової природи, антоціанів, хлорофілів, каротиноїдів.

Для вивчення якісного складу ліпофільних фракцій з трави, коренів та плодів розторопші методом тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру отримали тривимірні спектри флуоресценції (рис. 1.).

Так, для олії з плодів та ліпофільного комплексу з трави розторопші плямистої характерні піки в областях лехс - 270-З00 нм лem - 300-400 нм, що характерні для випромінення простих фенольних сполук, а також деяких ліпідів та фосфоліпідів. Серія піків в області збудження флуоресценції лехс від 300 до 700 нм та випромінення лem - 650-750 нм характерна для суміші хлорофілів А та Б. Як витікає з порівняння тривимірних спектрів, для олії з плодів розторопші вміст простих фенольних сполук, деяких ліпідів та фосфоліпідів набагато більший, ніж вміст хлорофілів. Для ліпофільного комплексу з трави розторопші спостерігається протилежне співвідношення вмісту компонентів, які мають флуоресценцію.

Крім того, у спектрі ліпофільного комплексу з трави та коренів розторопші спостерігається група піків в області лехс - 320-400, лem - 400-500 нм, характерних для випромінювання агліконів флавонолів. В тримвиірних спектрах олії з плодів розторопші ця група піків відсутня.

Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи рідинно-рідинної екстракції, колонкової адсорбційної хроматографії на силікагелі та поліаміді, препаративної хроматографії на папері і в тонкому шарі сорбенту.

З коренів, трави та плодів розторопші в індивідуальному стані виділено 26 речовин. На основі фізико-хімічних властивостей вихідних речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР спектроскопії, порівняння з вірогідними зразками встановлено їх структуру: простий фенол - арбутин; гідроксикоричні кислоти - кавова кислота, хлорогенова кислота; флавони - космосіїн, апігенін, апігенін-7-О-в-глюкуронід, лютеолін, цинарозид; флавоноли - кемпферол, кверцетин, мірицетин; глікозиди кемпферолу - кемпферол-7-О-рамнозид, популін; глікозиди кверцетину - рутин; флаволігнани - силібін, силіхристин, силідіанін, 2,3-дегідросилібін; флаван - таксифолін; антоціани - дельфінідин-3-О-глюкозид, мальвідин-3-О-глюкозид, ціанідин-3-О-глюкозид; сесквітерпенові лактони - алантолактон та ізоалантолактон; стероїди - в-ситостерин; органічні кислоти - кислота оксалатна.

Деякі фізико-хімічні властивості цих речовин наведено у таблиці 1. Арбутин, кислота оксалатна, алантолактон, ізоалантолактон, дельфінідин-3-О-глюкозид, мальвідин-3-О-глюкозид, ціанідин-3-О-глюкозид виділені вперше з сировини, що вивчалася.

Структуру виділених речовин встановлювали за допомогою фізичних, хімічних та фізико-хімічних методів аналізу.

Похідні простих фенолів. Речовину 1.1 за результатами якісних реакцій з кислотою сульфаніловою діазотованою, о-фталевим ангідридом віднесено до фенолів. При хроматографуванні аглікону речовини 1.1 у системі розчинників хлороформ-метанол (8:2) у порівнянні з вірогідним зразком гідрохінону за величиною Rf та забарвленням плям після обробки натрію гідроксидом і кислотою сульфаніловою діазотованою було підтверджено їх ідентичність. Співвідношення аглікону та цукрового залишку було 1:2,5. Проба змішування аглікону зі зразком гідрохінону не давала депресії температури плавлення. При хроматографуванні вуглеводного компоненту і D-глюкози на основі порівняння величин Rf було доведено їх ідентичність. Отже, речовину 1.1 за результатами проведених досліджень було ідентифіковано як гідрохінон-О-в-D-глюкопіранозид (арбутин) (табл. 1).

Гідроксикоричні кислоти. Речовини 1.2-1.3 за результатами якісних реакцій, даними хроматографічної поведінки, УФ- та ІЧ-спектрів віднесено до гідроксикоричних кислот.

В продуктах лужної деструкції речовини 1.2. (кавова кислота) і 1.3. (хлорогенова кислота) знайдено 3,4-дигідроксибензойну (пірокатехову) кислоту. Порівняння фізико-хімічних властивостей речовини 1.2. і кавової кислоти вказало на їх ідентичність. Лужний гідроліз речовини 1.3. призводив до утворення еквімолекулярних кількостей кавової і D-хінної кислот. Місце приєднання кавової кислоти до D-хінної встановлено лактонізацією речовини 1.3.

На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовини 1.2., 1.3. відповідно були ідентифіковані з 3,4-дигідроксикоричною (кавовою), 5-О-кофеїл- D-хінною (хлорогеновою) кислотою (табл. 1).

Таблиця 1

Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави та коренів розторопші

* - плями зявлялися на хроматограмі після обробки їх бромтимоловим синім.

Системи розчинників: 1 - н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); 2- 5% оцтова кислота; 3 - 15% оцтова кислота; 4 - хлороформ-кислота оцтова-вода (13:6:2); 5 -етилацетат-оцтова кислота-мурашина кислота-вода (100:11:11:25); 6 - етилацетат-мурашина кислота-вода (3:1:1), 7 - гексан-ацетон (7:3); 8 - петролейний ефір-хлороформ-етилацетат (3:2:1).

Флавоноїди. Флавоноїдна природа речовин 1.4-1.22 підтверджувалася якісними реакціями, даними хроматографічного, спектрального аналізу, продуктами гідролізу, фізико-хімічними характеристиками. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3400-2900 см^-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см^-1 (карбонільна група г-пірону), 1640-1450 см^-1 (валентні коливання ароматичних кілець).

За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, а також за результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовини 1.5 , 1.8., 1.10., 1.11 та 1.12. віднесено до агліконів, 1.6., 1.7., 1.9., 1.13. та 1.14. до глікозидів та 1.15. до біглікозидів.

Таким чином, за даними фізико-хімічних досліджень, УФ- та ІЧ-спектроскопії, а також за продуктами лужної деструкції та кислотного гідролізу, ацетилювання, метилювання ідентифіковано: речовину 1.4. як таксифолін, 1.5.-1.7. - апігенін, космосіїн, апігенін-7-О-в-глюкуронід, 1.8.-1.9. лютеолін та цинарозид; флавоноли 1.10.-1.12.- кемпферол, кверцетин, мірицетин; глікозиди кемпферолу 1.13.-1.14.- кемпферол-7-О-рамнозид та популін; глікозид кверцетину 1.15.- рутин, 2.20, 2.21., 2.22. - дельфінідин-3-О-глюкозид, мальвідин-3-О-глюкозид та ціанідин-3-О-глюкозид (табл.1).

Флаволігнани За допомогою якісних реакцій, а також за даними ПХ у системі розчинників 15% оцтова кислота з використанням відповідних реагентів встановили, що сполуки 1.16-1.19 є речовинами флавоноїдної природи. На підставі фізичних, фізико-хімічних властивостей та даних хроматографічного аналізу, ІЧ-спектрів речовини 1.16-1.19. було ідентифіковано, як силібін, силіхристин, силідіанін та 2,3-дегідросилібін відповідно. Ці речовини в траві та коренях розторопші ідентифіковано вперше.

Органічні кислоти На підставі фізико-хімічних властивостей та хроматографічного аналізу з вірогідними зразками речовину 2.23. ідентифіковано як кислоту оксалатну, яка виділена з трави розторопші вперше (табл.1).

Речовини ліпофільної фракції. На підставі фізичних, фізико-хімічних властивостей та даних хроматографічного аналізу, ІЧ-спектрів речовини 2.24 та 2.25 було ідентифіковано, як алантолактон та ізоалантолактон, а 2.26. - як в-сітостерин (табл. 1).

Визначення кількісного вмісту різних груп БАР вегетативних та генеративних органів розторопші

Наступним етапом нашої роботи стало визначення кількісного вмісту тих груп біологічно активних речовин, що містяться сировині, що вивчалася у значній кількості, або відомості про вміст яких суперечні чи відсутні.

Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначений якісний склад та кількісний вміст мінеральних сполук у траві, коренях, плодах та олії з плодів розторопші (табл. 2 ).

Таблиця 2

Вміст мінеральних сполук у траві, коренях, плодах та олії з плодів розторопші, мг/100 г

Встановлено наявність 22 макро- та мікроелементів. В значній кількості містяться К, Са, Mg, P.

За літературними даними розторопша використовується як кормова культура, тому було визначено якісний склад та кількісний вміст білково - полісахаридного комплексу у траві та коренях розторопші плямистої.

Результати вивчення якісного складу та кількісного вмісту амінокислот і загального білку у траві та коренях розторопші представлено в таблиці 3.

Таблиця 3.

Вміст амінокислот у траві та коренях розторопші, %

* Незамінні амінокислоти

У сировині, що вивчалася, було знайдено 15 звязаних амінокислот, у тому числі 7 незамінних. Максимальну кількість складають аспарагінова та глутамінова кислоти, аланін та лейцин.

Кількісний вміст полісахаридів у сировини, що вивчалася, визначали за фракціями: водорозчинні полісахариди, пектинові речовини, геміцелюлози А та Б (табл. 4).

Таблиця 4

Кількісний вміст полісахаридів в коренях, траві та плодах розторопші

В результаті експерименту було визначено кількісний вміст флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, суми окиснюваних поліфенолів, антоціанів, кислоти оксалатної, пектинових речовин, арбутину, алантолактону (табл. 5).

Таблиця 5.

Кількісний вміст основних груп БАР у сировині, що вивчалася

З метою комплексного дослідження були отримані ліпофільні фракції (ЛФ) з трави та плодів розторопші та встановлено кількісний вміст в них основних груп біологічно активних речовин: жирних кислот, хлорофілів, каротиноїдів та вітаміну Е (тільки в олії з плодів розторопші). Результати наведено у таблицях 6 та 7.

Таблиця 6

Кількісний вміст жирних кислот в ЛФ трави та олії з плодів розторопші плямистої

У олії з плодів та ЛФ з трави розторопші переважають ненасичені жирні кислоти : сумарний вміст ненасичених жирних кислот у траві складає - 51,6259 %, а у плодах - 58,5708 % що дає змогу прогнозувати F- вітамінну активність їх ліпофільних комплексів.

Таблиця 7.

Кількісний вміст жиророзчинних компонентів в ЛФ трави та олії з плодів розторопші плямистої

Спосіб отримання олії з плодів розторопші та цукрознижуючого збору, стандартизація сировини та субстанцій на її основі

Нами було розроблено технологічну схему отримання олії з плодів розторопші в умовах ФК “Здоровя” на попередньому етапі виробницт ...........