Структура и регуляция активности ферментов подсемейства 3А цитохрома Р-450 - научная работа

Резюме

Целью данного обзора является оценка имеющихся концепций индукции и ингибирования ферментов подсемейства CYP3A ксенобиотиками и другими химическими соединениями, с акцентированием роли ядерных рецепторов, мутаций экспрессируемых генов и их аллелей, внутривидовых вариаций, а также особенностей онтогенеза в этом процессе, поскольку в настоящее время все больше набирает вес утверждение, что имеется обширная база для взаимодействия среди членов семейства ядерных рецепторов, и причастности к вышеуказанному процессу стероидных рецепторов (подобных глюкокортикоидному рецептору (GR), и других факторов.

Введение

Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств на этапе метаболизма возникает при использовании препаратов, способных изменять активность ферментов. Ксенобиотики, какой бы структурой они ни обладали, встречают на своем пути в организме адекватный фермент, переводящий их или в состояние, удобное для использования в качестве энергетического и пластического материала, или в состояние, удобное для выведения из организма. Система биотрансформации ксенобиотиков состоит из ряда ферментных систем, локализованных в межклеточном пространстве, на клеточных и субклеточных мембранах, внутри органелл клетки. При этом процессы биотрансформации весьма сложны и обычно включают ряд последовательных стадий, каждая из которых опосредуется определенным ферментом.

Ферментные системы окислительного метаболизма обнаруживаются практически у всех живых организмов, где они играют важную роль в детоксикации любых эндо - или экзогенных веществ. Из них самой важной и мощной является система цитохрома Р-450 (CYP) (термин "цитохром Р-₄₅₀ " обозначает семейство изоферментов, которые сходны по физико-химическим, каталитическим и молекулярным свойствам.), которая рассматривается как наиболее универсальный биологический катализатор (так называемая "паяльная лампа"). Она объединяет мультигенное семейство гемопротеинов, ответственных за метаболизм многочисленных ксенобиотиков, включая терапевтические препараты, химикалии окружающей среды и диетические компоненты, а также эндогенные вещества, такие как жирорастворимые витамины, билирубин, тироксин, стероиды и желчные кислоты [Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,]. Никакая другая ферментная система не может соперничать с цитохромом P450 по диапазону метаболизируемых субстратов, различных по структуре и молекулярному весу - от метанола (MW=42), до циклоспорина А (MW=1203). Эта система представляет собой комплекс ферментов (цитохромы Р450 и b₅, NADPH- и NADH-редуктазы и фосфолипидный компонент мембран) сосредоточенных в мембранах эндоплазматического ретикулума или других компартментах клеток. Основной компонент системы - цитохром Р450, представлен суперсемейством монооксигеназ смешанной функции (MFO), ответственных за I стадию окислительного метаболизма, которая во многом определяет пути биотрансформации ксеноботиков в организме [Н.И. Головенко, 1980; А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Н.В. Адрианов, В.Ю. Уваров,1988; Lewis, Lake, 1997].

Цитохром Р450 (КФ 1.14.14.1) является типичным мембраносвязанным ферментом и большей частью своей молекулы погружен в липидный бислой, а каталитически активная гемовая часть расположена на границе раздела фаз. Проявление активности фермента возможно только в присутствии фосфолипидов или их аналогов, которые стабилизируют цитохром в функционально активной конформации [Н.В. Адрианов, В.Ю. Уваров,1988; В.Ю. Уваров и соавт., 1995; Dai et al., 1998; Yun et al., 1998]. Все цитохромы имеют консервативное структурное ядро и вариабельные участки в областях, вовлеченных в узнавание субстрата и связывание редокс-партнера [Peterson, Graham, 1998]. Особенности строения гидрофобного субстрат-связывающего кармана определяют субстратную избирательность фермента, поэтому, несмотря на значительную перекрестную специфичность, селективные субстраты и селективные ингибиторы отдельных цитохромов семейства P450 позволяют дать характеристику соответствующих его изоформ [Dai et al., 1998].["Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", Akua Agyeman, B.S., 1990, Seton Hall university]. Следует отметить, что из всех компонентов монокосигеназной системы только цитохром Р450 способен активировать молекулярный кислород, передавая ему электроны, полученные от NADPH и (или) цитохрома b₅ [А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Vaz et al., 1996; Coon et al., 1998]. Первый электрон поступает на цитохром Р450 от NADPH-редуктазы, второй - от цитохрома b₅. В случае же окисления NADH оба электрона поступают от цитохрома b₅. P450-катализируемая реакция моноокисления есть процесс, при котором один атом молекулярного кислорода реагирует с липофильным субстратом RH и в результате возникает гидрофобный метаболит ROH, вступающий в реакции коньюгирования с ферментами II стадии метаболизма. [Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,] (Рис.1).

Рис. 1 - Фазы окислительного метаболизма ксенобиотиков

Сам механизм монооксигеназной реакции в общих чертах выглядит следующим образом. На первой стадии происходит связывание окисленной формы цитохрома Р450 с субстратом и образование фермент-субстратного комплекса (Fe³⁺RH), существование которого подтверждается тремя типами спектральных изменений. Большинство субстратов вызывают изменения 1-го типа за счет увеличения доли высокоспиновой формы фермента. На второй стадии идет восстановление электроном поступающим от NADPH-редуктазы с образованием восстановленного фермент-субстратного комплекса (Fe²⁺RH). Затем присоединяется молекулярный кислород и образуется оксикомплекс (Fe²⁺О₂RH). На этой стадии может происходить разобщение комплекса в случае переноса электронов на кислород и после диссоциации комплекса возможно образование супероксидного анион-радикала. Для продолжения моноксигеназного цикла необходимо восстановление оксикомплекса вторым электроном и образование пероксикомплекса (Fe²⁺О₂-RH). Затем идет гетеролитический разрыв связи О-О с освобождением воды и образованием комплекса (FeO)³⁺RH, в котором существует электронодефицитный (шестиэлектронный) оксеноидный атом кислорода. Дальнейший механизм окисления субстрата с участием оксена называется оксеноидным.

Возможны три пути взаимодействия оксеноидного комплекса с молекулой субстрата: прямое внедрение кислорода в связь С-Н; отрыв атома водорода от субстрата с образованием радикала субстрата и координированного с железом гидроксильного радикала с последующей рекомбинацией; отрыв гидрид-иона с промежуточным образованием карбониевого иона из молекулы субстрата. По какому конкретному пути пойдет реакция определяется строением субстрата и другими факторами. Оксеноидный комплекс не единственный окислитель, функционирующий в монооксигеназном каталитическом цикле. Такая роль приписывается и другим гипервалентным железо-кислородным комплексам - нуклеофильному пероксижелезу, нуклеофильному или электрофильному гидропероксижелезу, каждый из которых имеет свои пути взаимодействия с субстратом [Vaz et al., 1996, 1998; Coon et al., 1998]. Существование различных окислителей в каталитическом цикле обеспечивает вариабельность молекулярных механизмов окисления субстратов, широкую субстратную специфичность монооксигеназ, большое разнообразие продуктов реакции.

Монооксигеназные окислительные реакции повышают полярность гидрофобного субстрата, делают его доступным для действия ферментов конъюгирующих субстрат с глюкуроновой, серной, уксусной кислотами, другими веществами по появившимся или освободившимся в результате окисления полярным группам (II фаза метаболизма ксенобиотиков) [Н.И. Головенко, 1980; А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; K.W. Bock et al., 1990]. Конечные продукты окисления и конъюгации, как правило, обладают более низкой биологической активностью и в силу большей растворимости в воде быстрее элиминируются из организма. По отношению к большинству лекарственных веществ и ксенобиотиков техногенного происхождения это означает утрату ими фармакологической активности или токсичности, однако в ряде случаев образуются биологически активные метаболиты, как например, алкилирующие метаболиты многих цитостатиков, активные метаболиты анальгетиков, антиконвульсантов, антиаритмиков, токсические метаболиты канцерогенов, гепатотоксинов [Wolf et al., 1996]. Т.о., хотя монооксигеназные реакции по своей сути направлены на защиту живых систем от накопления гидрофобных соединений, они тем не менее представляет определенную опасность для организма, так как неотъемлемой частью каталитического цикла является образование промежуточных активных метаболитов, продуктов неполного восстановления кислорода, которые оказывают повреждающее действие, химически модифицируя макромолекулы, нарушая проницаемость мембран, стимулируя реакции перекисного окисления [А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Chen, Cederbaum,1998; А.И. Арчаков и соавт., 1998].

В ряде случаев особо агресивные свойства образующихся интермедиатов и недостаточная эффективность их обезвреживания служат причиной гепато- и нефротоксичности, мутагенеза, канцерогенеза, тератогенеза, аллергии и других проявлений химически индуцированной токсичности (Рис.20 ["Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", Akua Agyeman, B.S., 1990, Seton Hall university].

Рис. 2 - Баланс между токсификацией и детоксификацией

CYP суперсемейство существует в течение более чем 1,5 миллиарда лет (Рис.3) [3,4].

Рис. 3 - Онтогенез цитохрома P450 (CYP) 3A4 и 3A7 активности

CYP система монооксигеназ, развившаяся, вероятно, в процессе совершенствования метаболизма стероидов как необходимая для сохранения мембранной целостности, впоследствии проявила себя как мощнейший фактор в дезактивации экзогенных соединений [5]. Считается, что все гены цитохрома Р450, от бактерий до человека, имеют общего предшественника, который появился более 2 млрд лет тому назад одновременно с появлением кислорода. В процессе эволюции происходило неоднократное разделение филогенетического дерева цитохрома Р450, что отражало состояние антагонизма между животными и растениями [Guengerich, 1992; Archakov, Degtyarenko, 1993; Lewis et al.,1998]. Наивысшие концентрации цитохрома Р-450 обнаруживаются в эндоплазматическом ретикулуме или микросомах гепатоцитов, меньшие - в энтероцитах тонкой кишки и еще меньшие - во внепеченочных тканях (почках, легких и мозге) [Gonzalez и другие., 1993; Pollock B. G. et al., 1999]. На сегодня обнаружено более 110 семейств цитохрома Р450, множество подсемейств и индивидуальных белков. Клонированы сотни генов различных цитохромов P450 у животных, растений, грибов и бактерий [Porter, 1995; Gonzalez, Lee, 1996]. Только у крыс их выделено более 50, а человека известно около 100 цитохромов P450, разделяемых на 17 семейств, кодируемых 48 генами и 10 псевдогенами. [Guengerich F.P., 1992; Beaune P., 1993; Horsmans, 1997; Ross A McKinnon, 2000], которые имеют значительные различия не только в структуре, вопросах активации и регуляции, субстратной специфичности итд, но и в аспектах онтогенеза.

[Saskia N.et all/Cytochrome P450 3A. Ontogeny and Drug Disposition, ClinPharmacokinetlW Dec: 37 (6);] Интересно, что растения имеют большее количество CYP генов, чем животные, из-за большего количества P450-зависимых критических путей метаболизма. Так, рекорд содержания цитохромов принадлежит маленькому растению Arabidopsis thaliana и равен 287, то есть приблизительно 1 % полного генома. [Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,]

В структуре всех изоформ цитохрома Р450 имеется консервативный участок вблизи СООН-конца, который содержит 26 аминокислотных остатков. В семейства включают белки, которые имеют около 36% подобия аминокислотного состава, в подсемейства - белки, аминокислотный состав, которых сходен на 65%. Внутри подсемейства белки имеют сходство более чем на 65%). [Akua Agyeman "Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", , B.S., 1990, Seton Hall university].

И до открытия цитохрома P450, было понятно, что эффективность многих лекарственных препаратов определяется скоростью их биотрансформации организмом. Активность лекарственных средств, метаболизирующихся ферментами печени заметно изменялась, когда животным дополнительно вводились гормоны, инсектициды и канцерогенные вещества - возникающая при этом ферментативная индукция ускоряла биотрансформацию лекарственных препаратов, уменьшая продолжительность и интенсивность их действия [Somogyi A, Kovacs K, Solymoss B, Kuntzman R, Conney AH. 1971. Suppression of 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-produced adrenal necrosis by steroids capable of inducing aryl hydrocarbon hydroxylase. Life Sci. 10:1261-71]. Характер индукции ферментативной активности определялся типом индуктора, что свидетельствовало о существовании ряда ферментных систем, т.е. что большой спектр каталитической активности обеспечивается множественными ферментами, а не отдельный изоформой [Lu AYH, Somogyi A, West S, Kuntzman R, Conney AH. 1972. Pregnenolone-16-carbonitrile: a new type of inducer of drug-metabolizing enzymes. Arch. Biochem. Biophys. 152:457-62] [Bryan Goodwin, Matthew R. Redinbo, and Steven A. Kliewer, Regulation of CYP3A gene transcription by the PXR Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. 42:1-23].

Всего несколько десятилетий тому в печени крыс, подвергнутых воздействию фенилэтилбарбитуровой кислоты, был идентифицирован первый индуцибельный P450 (теперь классифицируемый как CYP2B) [Gonzalez и другие, 1993] и выдвинут постулат, подтвержденный только недавно, что посредником индукции является рецепторный белок. Позже был идентифицирован второй уникальный P450 (теперь классифицируемый как CYP1A), индуцируемый арилгидрокарбоном и 3-метилхолантреном, и детально описана его регуляция лиганд-активируемым рецептором. В начале 1980-ых, несколько групп исследователей идентифицировали третью форму P450 (теперь классифицируемую как CYP3A), индуцируемую веществами стероидной природы.

Эти исследования обеспечили понимание многих фармакологических, биохимических и биофизических свойств P450 ферментов, включая белковую структуру, специфику субстратов и кинетику фермента. В процессе развития молекулярной биологии стало возможным раскрытие особенностей структуры и функции гена P450, что объяснило феномены наблюдаемые фармакологами в более ранних исследованиях.

Среди цитохромов P450 печени и кишечника человека изоформа CYP3A является наиболее широко представленной составляя примерно 60 % от общего количества цитохромов в данных органах и около 30% - в организме. Она индуцируется многими субстратами, включая естественные и синтетические глюкокортикоиды (дексаметазон, тестостерон, кортизол) 6-beta-гидроксилирование которых она катализирует, прегнан-производные (прегненолон, 16-карбонитрил, прогестерон), антибиотики с макроциклическим лактонным кольцом (рифампицин, эритромицин), цитостатики и многие другие. Ферменты этой группы принимают участие в метаболизме примерно 60% всех лекарственных препаратов и отвечают за возникновение лекарственных взаимодействий практически во всех случаях, когда это касается индукции микросомальных ферментов или их ингибирования [Wrighton и Stevens, 1992; Gonzalez и другие., 1993; Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition, Francois BERTHOU; Ross A McKinnon, Allan M Evans, 2000;].

Таблица 1 - Каталитическая активность к CYP3A субстратам в микросомах печени человека

Относительно взрослых = 100 %.

CBZ-E = карбамазепин-10,11-эпоксид;

DHEA = дегидроэпиандростерон;

DHEA-S = дегидроэпиандростерон 3-сульфат;

IQ = гетероциклический амин: 2-амино-3-диметил-имидазо[4.5-/]квинидин;

MelQ = гетероциклический амин :2-амино-3.4-диметил-имидазо[4,5-]квинидин;

3MM = 3-метокси-меторфан;

ND = не определяется; + к указаны увиличение уровней экспрессии; - нет указаных уровни экспресии; ? указанная экспрессия не известна.

Таблица 2 - Сравнительная характеристика основных CYP3A изоформ

Множественные формы CYP3A присутствуют в печени крыс и мышей, одна изоформа обнаружена у кроликов, у человека были идентифицированы четыре CYP3A гена [Gonzalez и другие, 1993; Domanski и другие, 2001]. CYP3A гены кодируют наиболее распространенные CYP ферменты у людей, включая CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, и CYP3A43 [Wildt и другие, 1999; Gellner и другие, 2001]. Считается, что CYP3A4 является преобладающей формой в печени взрослого человека. CYP3A5 является полиморфной формой, чье присутствие в печени взрослого человека выражено переменной степенью. CYP3A5, как полагают, присутствует в печени, приблизительно у 20 % европейцев, однако последние исследования свидетельствуют о том, что, CYP3A5 экспрессируется и в печени более чем у 50 % негров [Lown и другие, 1994; Wildt и другие., 1999; Wandel и другие., 2000; Kuehl и другие., 2001] CYP3A4 и CYP3A5 распределены в множественных тканях, включая не только печень, но также кишечник и почки [Thummel и Wilkinson, 1998; Guengerich, 1999]. CYP3A7 - изоформа, найденная в тканях кишечника, репродуктивных органах, и печени младенцев, представлена также и в печени некоторых взрослых людей [Kitada и другие, 1985; Schuetz и другие., 1994]. Недавно был идентифицирован новый член семейства CYP3A (CYP3A43) - CYP3A43 mRNA найдена в основном в простате взрослого человека, хотя также представлены и в других тканях, включая печень, где индуцируется рифампицином [Gellner и другие, 2001] Westlind и другие. (2001) утверждают, что уровни CYP3A колеблются в печени на протяжении жизни индивидуума [Shimada и другие., 1994; Oesterheld, 1998]

Еще начальные фармакологические исследования продемонстрировали индукцию CYP3A глюкокортикоидами и, как это ни парадоксально, антиглоюкокортикоидами, что привело к идее существования неклассического глюкокортикоид-рецепторного механизма была и в итоге - к идентификации уникального представителя ядерного семейства рецепторов, прегнан X рецептора (PXR; NR1I2). Становилось все более и более очевидно, что PXR, также как другие ядерные рецепторы, посредник в процессе индукции CYP3A, где играет сложную роль, включая индуцибельность структурно разнообразными составами и обладает поразительными внутривидовыми различиями в индукционных профилях. Понимание значения роли ядерных рецепторов в регуляции экспрессии CYP3A и других генов P450 семейства предполагает дальнейшее определение физиологически функциональных и внутривидовых различий CYP3A в состоянии здоровья и болезни у человека.

Прегнан X рецептор (PXR)- представитель суперсемейства ядерных рецепторов, который появился в связи с развитием протекции организма от токсических химических веществ. PXR активируется структурно разнообразным спектром ксенобиотиков, включая широко используемые лекарственные препараты. Различные липофильные составы, продукты жизнедеятельности организма, такие как, желчные кислоты и стероиды, также активизируют PXR. PXR стимулирует транскрипцию цитохрома P450 3A монооксигеназ и других генов, вовлеченные в детоксикацию и элиминацию потенциально токсических веществ. Исследования PXR активации имеют важное значение для проектирования будущих лекарственных препаратов по двум причинам: с одной стороны, они могут использоваться, для определения возможностей отдельного лекарственного средства индуцировать экспрессию CYP3A гена и его взаимодействия с другими лекарственными препаратами. С другой стороны, PXR агонисты могут оказаться полезными в лечении заболеваний, при которых присходит аккумуляция токсических метаболитов, например холестатический синдром печени.

PXR включает стероид, ретиноид и рецепторы гормона щитовидной железы. Члены данного семейства функционируют как лиганд-активизируемые факторы транскрипции и играют основную роль в почти каждом аспекте развития индивидуума, а так же в физиологии взрослого организма. Члены семейства имеют общую структуру домена, которая включает высококонсервативную DNA, связанную с доменом (DBD) двумя “цинковыми пальцами”. DBD является рецептором-мишенью для коротких отрезков DNA (так называемых элементов ответа) в регуляторных областях целевых генов. Карбокси-терминалый регион ядерных рецепторов включает сохраненный лигандсвязующий домен (LBD), который служит сайтом состыковки лигандов, а также содержит мотивы димеризации и домены активации транскрипции (активатор функции - 2 (AF-2) геликса). Прикрепление лиганда к LBD заканчивается конформационным изменением в AF-2 геликсе, которое позволяет ядерному рецептору взаимодействовать с акцессорными белками и активизировать экспрессию целевых генов [48, 57, 58] [Bryan Goodwin¹, Matthew R. Redinbo², and Steven A. Kliewer ^, Regulation of CYP3A gene transcription by the PXR,Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. 42:1-23.].

Кульминацией вышеуказанных исследований можно считать признание того, что ядерные рецепторы подобные охарактеризованным для стероидных гормонов являются средствами индукции CYP3A. Таким образом, обширные данные, накопленные в процессе изучения этой группы физиологических лиганд-активируемых факторов транскрипции могут теперь быть расширены на всю систему метаболизма лекарственных средств.

Имеется большое количество факторов, способных воздействовать на токсичность и биотрансформацию лекарственных средств. Они обычно классифицируются на генетические и не-генетические, а также факторы окружающей среды. В последней категории, химическая экспозиция, в случае назначения лекарственных препаратов, профессиональные вредности на рабочем месте или загрязнение окружающей среды, воздуха и воды, ведет или к индукции или к ингибированию токсичности и метаболизма химических веществ.

Индукция определена как увеличение количества и активности метаболизирующего препарат фермента (DME), главным образом цитохромом P450 семейств от 1 до 4. Это длительное (часы и дни) последствие экспозиции химическим веществом.

Ингибирование ферментов P450 означает любое снижение уровня метаболизма специфического ксенобиотика другим ксенобиотиком, за счет одновременного присутствия в активном сайте фермента. В CYP3A семействе наблюдается также, активация P450 фермента аллокринными процессами.

Итак, классическое определение индукции - de novo синтез новых молекул фермента в результате увеличения транскрипции его гена после стимуляции соответствующим химическим сигналом.

Интересным можно считать сообщение о том, что гормон роста и трийодтиронин регулируют гидроксилирование стероидов цитохромом P-450 (CYP) 3A изоформой, которая конститутивно экспрессируются главным образом в перивенозных областях печени. Сравнивая лизаты клеток, полученные от перипортальных и перивенозных ацинарных областей наблюдалось увеличение CYP3A экспрессии после гипофизэктомии, что происходило главным образом благодаря увеличению экспрессии в обычно малоактивной перипортальной области. Этот эффект был особенно сильно выражен у особей женского пола. Прием гормона роста восстанавливал перивенозный уровень экспрессии, что было подтверждено иммуногистохимическим анализом секций печени. Анализ перипортальных и перивенозных mRNA обратно транскриптазной PCR демонстрирует, что у мужчин изменения CYP3A2 mRNA происходят паралельно с изменениями на белковом уровне. У женщин, CYP3A2 mRNA был обнаружен только после гипофизэктомии, поэтому казалось, что зональные белковые изменения предшествуют изменениям уровням CYP3A1 mRNA. Применение животными с гипофизэктомией трийодтиронина также подавляло экспрессию CYP3A, как у самцов, так и у самок.

Однако, это произходило почти исключительно в перипортальных областях, что определялось и на белковом уровне, методами иммуноблоттинга и иммуногистохимически, а так же на CYP3A1 и 3A2 mRNA уровнях. Эти результаты указывают на то, что гормон роста и гормон щитовидной железы регулируют экспрессию CYP3A генов зоно- специфически, подавляя их транскрипцию в перипортальных областях печени. [Oinonen T, Lindros KO. Hormonal regulation of the zonated expression of cytochrome P-450 3A in rat liver.Biochem. J. (1995) 309, (55-61) (Printed in Great Britain)] Известно, что большинство взаимодействий лекарственных средств, посредством CYP3A - результат или индукции или ингибирования этого фермента [241]. CYP3A4 активность может быть индуцирована in vitro и in vivo кортикостероидами (например дексаметазоном), противосудорожными средствами (например фенилэтилбарбитуровая кислота, фенитоин, карбамазепин) и некоторыми антибиотиками например рифампицин, рифапентин (рифампицин стимулирует 7-этоксикумарин O-деэтилирование (ECOD) активность в микросомах человеческих легкого. Однако многие известные индукторы CYP3A4, такие как дексаметазон, рифампицин или фенилэтилбарбитуровая кислота, не индуцируют CYP3A5 активность in vitro. Некоторые индукторы, однако, увеличивают в печени CYP3A белковые уровни у животных при помощи стабилизации. Такая посттранскрипционная регуляция сначала демонстрировалось для тролеандомицина и других антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом, которые образуют устойчивые комплексы с ферментом. Механизм, благодаря которому это взаимодействие стабилизирует CYP3A относительно последующей деградации, неясен, но может быть связано с процессом цАМФ-зависимого фосфорилирования , который принимает участие в белковой денатурации (159)[Thummel K.E., In vitro and in vivo drug interactions involving human CYP3A.,Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. 38:389-430]

В современных изучениях, использующих субстраты, связанные в активном гомологичном сайте CYP3A4 и моделированные подобно бактериальному CYPBM-3, было доказано, что водородная связь большинства субстратов с Asn74 остатком CYP3A4 происходит часто наряду с составляющей Phe72 [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.; Tomlinson ES, Lewis DFV, Maggs JL, Kroemer HK, Park BK and Back DJ (1997) In vitro metabolism of dexamethasone (DEX) in human liver and kidney: The involvement of CYP3A4 and CYP17 (17,20 LYASE) and molecular modelling studies. Biochem Pharmacol 54: 605-611; Lewis DFV and Lake BG (1998) Molecular modelling and quantitative structure-activity relationship studies on the interaction of omeprazole with cytochrome P450 isozymes. Toxicology 125: 31-44] . Точно так же водородная связь с Asn74, кажется, происходит с ингибиторами подобными кетоконазолу и гестодену [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.]. Кроме того, Льюис и др. [Lewis DFV, Eddershaw PJ, Goldfarb PS and Tarbit MH (1996) Molecular modelling of CYP3A4 from an alignment with CYP102: Identifcation of key interactions between putative active site residues and CYP3A- specific chemicals. Xenobiotica 10: 1067-1086.] утверждают, что предполагаемые структурные требования CYP3A4 субстратов включают водород-связующий акцепторный атом, который находится на расстоянии 5.5 до 7.8 A от сайта метаболизма, который в свою очередь находится на 2 до 4 A от молекулы кислорода в геме. Дальнейшая молекулярная модель CYP3A4 основанна на ее последовательном сравнении со всеми четырьмя бактериальным CYPS, и наводит на мысль, о взаимодействии множественных гидрофобных областей с субстратами прогестероном и эритромицином [Szklarz GD and Halpert JR (1997) Molecular modeling of cytochrome P4503A4. J Comp Aided Mol Des 11: 265-272.]. Дополнительные изучения, проведенные Halpert и др. [Harlow GR and Halpert JR (1997) Alanine-scanning mutagenesis of a putative substrate recognition site in human cytochrome P4503A4. J Biol Chem 272: 5396-5402; Domanski TL, Liu J, Harlow GR and Halpert JR (1998) Analysis of four residues within substrate recognition site 4 of human cytochrome P450 3A4: Role in steroid hydroxylase activity and alpha -napthoflavone stimulation. Arch Biochem Biophys 350: 223-232.] с использованием аланин-сканирующего мутагенеза идентифицировали остатки аминокислоты, необходимые для субстратной специфики и флавоноид активации CYP3A4. [Three-Dimensional-Quantitative Structure Activity Relationship Analysis of Cytochrome P-450 3A4 Substrates., Sean Ekins, Gianpaolo Bravi , James H. Wikel and Steven A. Wrighton]

Необходимо отметить, что ингибирование фермента, метаболизирующего лекарственное средство, - возможно наиболее частая причина, лежащая в основе клинически важного фармакокинетического взаимодействия лекарственных средств. Ферменты цитохрома P450 (CYP) отвечают за большую часть 1 фазы метаболизма лекарственных средств. По этой причине, вопросы ингибирования этих ферментов - клинически важная проблема из за которой приходилось неоднократно удалять лекарственные препараты с рынка. Например, антигистаминный препарат терфенадин, который подвергается быстрому и интенсивному метаболизму путем гидроксилирования метильной группы, которая далее окисляется до активного метаболита фексофенадина, в обоих случаях основная роль принадлежит CYP3A4. (Рисунок 6.) При совместном приеме с ингибиторами CYP3A подобными кетоконазолу и эритромицину, происходит ингибироваение метаболизма препарата, ведя к серьезному увеличению концентрации терфенадина, стимулируя желудочковые аритмии.

Рис. 6 - Метаболизм терфенадина

Антидиабетическое лекарственное средство троглитазон было удалено с рынка лекарственных средств из-за инцидентов, связанных с возникновением явлений фатальной гепатотоксичности [N. Engl. J.Med 338, 916, 1998; Drug Metab. Dispo 27, 1260, 1999].

Как извесно, примерно 5% всех жителей США имеют генетический дефицит изоформ цитохрома 2-6, который участвует в метаболизме бета - блокаторов, нейролептиков и антидепрессантов. У этих пациентов не бывает ингибирования этой формы фермента хинидином, что наблюдается у всей остальной популяции. Ингибирование изоформы 3А встречается часто и вызывается большим количеством препаратов, часто применяющихся в практике. Это могут быть: кетоконазол, флюконазол, циклоспорин, ритонавир, дилтиазем, нифедипин, никардипин, флуоксетин, хинидин, верапамил и эритромицин (Таб.2). [Ross A McKinnon, 2000]

Таблица 2 - Ферменты цитохрома 450 3А вовлеченные в лекарственный метаболизм.

Антибиотики с макроциклическим лактонным кольцом могут стимулировать их собственную печеночную биотрансформацию до нитрозоалканов. Эти метаболиты получены при метаболическом окислении ±N(CH3)2 группы антибиотика и передаче ±NO группы. Нитрозоалканы впоследствии формируют инактивные CYP 3A4-iron-метаболит комплексы (Рисунок 8) результатом является ингибирование CYP 3A4-зависимой каталитической активности [3/ Pessayre D, Larrey D, Funck-Brentano C, et al.Drug interactions and hepatitis produced by some macrolideantibiotics. J Antimicrob Chemother 1985; 16(Suppl H): 181±194.]. Этот механизм объясняет большинство взаимодействий лекарственных средств, с участием антибиотиков с макроциклическим лактонным кольцом [4/ Periti P, Mazzei T, Mini E, Novelli A. Pharmacokinetic drug interactions of macrolides. Clin Pharmacokin 1992; 23:106±131.].

Вещества с макроциклическим лактонным кольцом отличаются по их способностям связаться и ингибировать изоформу CYP 3A4 цитохром P-450 [3/ Pessayre D, Larrey D, Funck-Brentano C, et al.Drug interactions and hepatitis produced by some macrolide antibiotics. J Antimicrob Chemother 1985; 16(Suppl H):181±194., 5/ Gascon PM, Dayer P. Comparative effects of macrolide antibiotics on liver mono-oxygenases. Abstract. Clin PharmacolTher 1991; 49: 158.7. 6/ Ohmori S, Ishii I, Kurina SI, et al. Effects of clarithromycin and its metabolites on the mixed function oxydase system in hepatic microsomes of rats. Drug Metab Dispos 1993; 21:358±363.,7/ Lindstrom TD, Hanssen BR, Wrighton SA. Cytochrome P-450 complex formation by dirithromycin and other macrolides in rat and in human liver. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 265±269.]. Вышеуказанные различия побудили von Rosenstiel & Adam [8/ Von Rosenstiel NA, Adam D. Macrolide antibacterials. Drug interactions of clinical signi?cance. Drug Safety 1995; 13: 105±122.] классифицировать макролиды на три группы на основе данных, обеспеченных в экспериментах in vitro.

Группа 1 включает эритромицин и тролеандомицин. Оба лекарственных препарата прочно связываются и ингибируют CYP 3A4.

Кларитромицин принадлежит ко 2 Группе. Его Эксгибиция имеет более низкую степень родства к CYP 3A4, по сравнению, с эритромицином, и формирование комплексов происходит в меньшей степени;

Группа 3 включает азитромицин и диритромицин. Эти составы продемонстрировали слабую степень взаимодействия с системой цитохрома P-450 in vitro.

Кларитромицин проявляет сходство с эритромицином в некоторых взаимодействиях лекарственных средств (например с психотропными средствами) что основано на результатах клинических исследований. Кроме того, множество данных, полученных при анализе клинических случаев демонстрируют, что азитромицин и диритромицин имеют потенциал для взаимодействий лекарственных средств, хотя гораздо меньшей степени чем эритромицин. Несоответствие между тем, что ожидается от данных, полученных in vitro и тем, что может наблюдаться в клинической практике, подчеркивает известную внутривидовую вариабильность степени каталитической активности цитох ...........