НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АБРАМОВ АРТУР ВІКТОРОВИЧ

УДК 636.09.616.921.5:598.2:636.5

ЕпізоотологічнІ ОСОБЛИВОСТІ грипу птахів В УкраїнІ

16.00.08 - епізоотологія та інфекційні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державному вищому навчальному закладі „Державний агроекологічний університет” Міністерства аграрної політики України, м. Житомир

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор Галатюк Олександр Євстафійович, Державний вищий навчальний заклад „Державний агроекологічний університет”, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології;

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор Ткаченко Олексій Андрійович, Дніпропетровський державний аграрний університет, завідувач кафедри епізоотології та інфекційних хвороб.

Захист дисертації відбудеться “18” березня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ 41, вул. Героїв Оборони 15, навчальний корпус №3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ 41, вул. Героїв Оборони 13, навчальний корпус №4, кім. 28

Автореферат розісланий “12” лютого 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ______________ С.В. Міськевич

33

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Грип птахів реєструється більш ніж у 50 країнах світу та завдає значних економічних збитків (Swayne D., 2004; Покровский В.И. и др., 2005; Yegani M., 2005). У 2005-2006 роках епізоотичні вогнища захворювання птахів на грип виявлені на території Росії, Грузії, Азербайджану, Казахстану та України (Герман В.В. та ін., 2006; Луговская Н.Н. и др., 2006; Онищенко О.О. и др., 2006; Стегній Б.Т. та ін., 2006).

Проведення епізоотологічного моніторингу грипу птахів в Україні показало, що наявність антитіл до збудника грипу виявляється у різних видів птахів з вираженою тенденцією до підвищення титрів специфічних антитіл у птахів, що стаціонарно мешкають на територіях, через які пролягають шляхи міграції перелітних видів (Абрамов А.В., Герман В.В., 2006; Могилевський Л.Я. та ін., 2006).

Встановлено, що джерелом збудника інфекції є хворі та перехворілі птахи, які виділяють у навколишнє середовище віруси аерогенним шляхом, а також зі слиною, послідом, що створює передумови зараження їх через повітря, корми та воду. Так, екскременти водоплавних птахів-вірусоносіїв потрапляють до води річок та озер, а при подальшому її використанні для напування птахів та при харчуванні останніх водними тваринами може сформуватися водний шлях передачі вірусу грипу (Сюрин В.Н. та ін., 1998; Львов Д.К., 2000; Wright P.F., Webster R.G., 2001; Каверин Н.К., Смирнов Ю.А., 2003).

Відоме антигенне різноманіття збудника грипу, різний рівень патогенності циркулюючих у природі штамів, а також особливості патогенезу та прояву хвороби у тварин різних видів аргументують важливість і необхідність проведення відповідного епізоотологічного моніторингу, включаючи як наземні, так і водні осередки пташиного грипу, орієнтують на розробку та впровадження в практику ветеринарної медицини раціональних і ефективних методів визначення ступеня вірулентності штамів (ізолятів), які обумовлюють спалах хвороби.

У звязку з вищенаведеним, епізоотологічний моніторинг грипу птахів, зокрема вивчення особливостей збереження вірусу і його поширення у наземному та водному середовищах, наявність проміжних господарів (личинки комах, риби, земноводні) є вкрай необхідним, а розробка інтегральної системи контролю за спалахами хвороби на території України є нагальною потребою сьогодення.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет” та у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини згідно з темою “Крайова епізоотологія, розробка методів діагностики та боротьби з інфекційними хворобами тварин”, номер державної реєстрації 0107U002473.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - визначити особливості циркуляції вірусу та формування природних наземних і водних осередків грипу птахів в України для удосконалення системи профілактичних та оздоровчих заходів.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

- здійснити епізоотологічне обстеження птахівничих господарств, деяких перелітних, синантропних та птахів приватного сектору на території України щодо пташиного грипу;

- виділити епізоотичні штами збудника високопатогенного пташиного грипу та провести їх молекулярно-генетичний аналіз;

- вивчити особливості циркуляції збудника та формування природних наземних і водних осередків грипу птахів у південному регіоні України;

- визначити морфофункціональні зміни у зародків курчат та риб, заражених вірусом грипу, який виділений з личинок комах - хірономід (мотиль);

- розробити ефективну електронну інтегральну систему контролю за спалахами пташиного грипу в Україні.

Обєкт дослідження - грип птахів, збудник грипу птахів.

Предмет дослідження - епізоотична ситуація щодо грипу птахів в України, особливості перебігу хвороби, джерела збудника грипу, порівняльний молекулярно-генетичний аналіз епізоотичних ізолятів вірусу високопатогенного грипу, система контролю грипу птахів.

Методи дослідження. Епізоотологічні (епізоотологічне обстеження), клінічні (огляд і пальпація птахів, визначення маси, довжини та коефіцієнта вгодованості коропів), гематологічні (визначення кількості еритроцитів та лейкоцитів); патолого-анатомічні (патолого-анатомічний розтин), гістологічні (гістоструктура тканин курячих ембріонів), серологічні (дослідження в РГА, РЗГА та ІФА), вірусологічні (ізоляція, ідентифікація та культивування вірусів на культурі клітин), молекулярно-біологічні (ідентифікація та молекулярно-генетична оцінка вірусу в ПЛР), імунологічні (бактерицидна та лізоцимна активність сироватки крові), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчена епізоотична ситуація щодо поширення грипу птахів, обумовленого різними штамами вірусу грипу на території України. Встановлено, що на формування стаціонарних осередків неблагополуччя значно впливає видовий склад птахів, що мешкають на цій території. Високопатогенний вірус грипу виділено від птахів видів Phalacrocorax carbo, Anas platyrhynchos, Anser albifrons, Fulica atra, які мешкають у водних та біляводних біотопах. Птахи пятого виду (Turdus philomelos) надають перевагу сухій рівнинній місцевості, а для місць гніздування шостого виду (Sturnus vulgaris) не обовязкова наявність великих водоймищ. Вперше встановлена циркуляція високопатогенного вірусу грипу H₅N₁ у птахів на території України і доведена відсутність мутацій з адаптації вірусу до рецепторів епітеліальних клітин верхніх дихальних шляхів людини, до яких вірус грипу є тропним. Визначені та нанесені на карти епізоотичного стану районів півдня України природні водні осередки, де від птахів були виділені штами вірусу H₅N₁ високопатогенного грипу птахів. Встановлено тривале виживання (протягом року) високопатогенного вірусу H₅N₁ в природному осередку неблагополуччя на південній косі узбережжя Азовського моря (патогенний вірус H₅N₁ виявлено у мотилі та бентосі). Експериментальними дослідженнями доведена тривала циркуляція вірусу пташиного грипу H₅N₁ в організмі холоднокровних (мотиль, пявка, риба).

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень використані при розробці “Національної програми по ліквідації спалахів високопатогенного грипу птахів та хвороби Ньюкасла”. Створені карти поширення грипу птахів на території України, що збігаються із шляхами міграції перелітних птахів. Матеріали дисертаційної роботи використані при розробці “Інструкції по заходах боротьби з грипом птиці”, яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України (наказ № 96 від 26.10.2005.) та Міністерством юстиції України (наказ № 1304/1158 від 31.10.2005). У Центральній державні лабораторії ветеринарної медицини впроваджено діагностику грипу птахів методами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) при обовязковій детекції продуктів ампліфікації в електрофорезному гелі та у реальному проміжку часу (ПЛР “реал-тайм”). При надгострому перебігу високопатогенного грипу, який супроводжується масовою загибеллю птахів, з діагностичною метою запропоновано, в першу чергу, застосовувати ПЛР та ПЛР “реал-тайм”.

Виділено високопатогенний штам вірусу грипу “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H₅N₁)” та проведено його депонування в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів (депозитарій №435).

Розроблена і впроваджена електронна інтегральна програма контролю за спалахами пташиного грипу в Україні, а також система профілактичних заходів при реєстрації спалахів пташиного грипу, яка рекомендована для виконання керівниками птахівничих та рибоводних господарств, а також мисливцями та рибалками.

За результатами досліджень отримано два патенти: “Біологічний засіб діагностики збудника паразитарної хвороби у людини або тварини” (патент України №13934 від 17.04.2006 р.) та “Спосіб контролю поширення захворювання пташиного грипу” (патент України №18122 від 16.10.2006 р.).

Одержані результати досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрах: мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет”; епізоотології та інфекційних хвороб Національного аграрного університету; епізоотології та інфекційних хвороб Білоцерківського державного аграрного університету. Матеріали дисертаційної роботи використовують на курсах підвищення кваліфікації фахівців ветеринарної медицини у вищевказаних університетах.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному плануванні та виконанні експериментальної частини роботи, зокрема організації і проведенні дослідів, відборі матеріалу, проведенні клінічних, серологічних, патолого-анатомічних досліджень. Частина досліджень (вірусологічні та молекулярно-біологічні) виконані спільно із співробітниками відділів вірусології, а також імунологічних та моніторингових досліджень Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини. Аналіз та узагальнення літературних джерел, первинних матеріалів, статистичну обробку та оформлення рукопису здобувач зробив самостійно. Гістологічні дослідження курячих ембріонів, заражених високопатогенним вірусом грипу “A(chironomida)Azov/ 11/2006(H₅N₁)”, виконані спільно з доцентом кафедри ветеринарно-санітарної експертизи та патологічної анатомії Білоцерківського державного аграрного університету, к.вет.н. І.В. Панченком.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені та проаналізовані на Міжнародних науково-практичних конференціях: “Високопатогенний грип птиці: актуальні аспекти епізоотології, епідеміології, діагностики та профілактики” (сел. Новий Світ, АР Крим, 2006 р.); “Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных и птиц” (м. Самарканд, 2006 р.); “Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології” (м. Феодосія, 2007 р.); “Регіональні проблеми екології ветеринарної медицини”, присвяченій 20-річчю факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу “ДАУ” (м. Житомир, 2007), та на науково-практичних конференціях: присвяченій 75-річчю Новогалещинської біофабрики (м. Полтава, 2006 р.); “Перспективи розвитку ветеринарної медицини України”, присвяченій 10-річчю факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ (м. Луганськ, 2007 р.); щорічних звітних конференціях професорсько-викладацького складу факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу “ДАУ” (2005-2007 рр.); засіданнях кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “ДАУ”.

Публікації. Результати досліджень, які представлені у дисертації, опубліковані у 10 друкованих працях: науково-виробничому щомісячнику Державного департаменту ветеринарної медицини “Ветеринарна медицина України” (2), у міжвідомчому тематичному науковому збірнику “Ветеринарна медицина” (2), “Віснику Білоцерківського державного аграрного університету” (1), “Віснику Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет” (1), “Збірнику наукових праць Луганського національного аграрного університету” (1), матеріалах Міжнародної конференції з пташиного грипу (1), патентах (2).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 211 сторінках компютерного тексту (основний текст роботи - 136 с.) і складається зі вступу, огляду літератури, власних досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків і пропозицій для виробництва, 17 додатків, списку використаних джерел, який включає 290 найменувань, у тому числі 156 - іноземних; містить 16 таблиць, 19 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Вибір напрямків досліджень, матеріал та методи виконання роботи

Дослідження виконувались з 2003 по 2007 рік у науковій лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет”, у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини, а також у референтних центрах з вивчення грипу птахів VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральній державній установі “Федеральний центр охорони здоровя тварин” (Володимир, Росія) і Федеральній державній установі “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія).

Епізоотологічний моніторинг грипу птахів проводився серед різних видів птахів у різних областях України та АР Крим. У 2003-2006 роках було досліджено на грип птахів 423098 проб. Згідно з рекомендаціями МЕБ діагноз на грип птахів встановлювали комплексно з врахуванням результатів епізоотологічних, клінічних, патолого-анатомічних та лабораторних (РГА, РЗГА, ПЛР та ІФА) методів досліджень. Для досліджень на грип відбирали свіжі трупи та хвору птицю у кількості не менше пяти голів з кожної групи, підозрілої у захворюванні (Manual of diagnostic tests, 2004). Для вірусологічних досліджень відбирали проби змивів з глотки та клоаки, внутрішні органи (легені, трахею, селезінку, печінку, повітроносні мішки) та головний мозок. Для проведення ретроспективної діагностики відбирали не менше 25 проб сироваток крові від однієї групи птахів.

Проби змивів доставляли до лабораторії для проведення вірусологічних (ізоляція вірусу на курячих ембріонах з наступною ідентифікацією) та молекулярно-генетичних досліджень. Для деконтамінації змивів до середовища 199, в якому їх транспортували, додавали антибіотики (4 %-й розчин гентаміцину сульфату, 1000 мкг/см³). Для транспортування проби (змиви, шматочки внутрішніх органів) спочатку охолоджували до +4 єС, а потім заморожували в морозильнику до -20 єС, після чого в термосах з сухим льодом доставляли до лабораторії. Для ізоляції та типізації вірусу грипу із відібраних проб органів та тканин ураженої птиці готували гомогенати 1:10 на 0,9 %-му розчині NaCl або фосфатному буфері (рН 7,2-7,4) з додаванням пеніциліну та стрептоміцину. Одержані гомогенати звільняли від часток тканин центрифугуванням та використовували для зараження курячих ембріонів (Сюрин В.Н. та ін., 1998).

Зразками вірусовмістимої рідини заражали 10-добових курячих ембріонів, з розрахунку не менше 5 ембріонів на одну пробу. Зараження проводили в алантоїсну порожнину. Інфіковані ембріони інкубували при +41 єС упродовж 3-5 діб. У разі наявності вірусу в пробі, загибель наставала через 48-72 години після зараження. Ембріони, що загинули, розтинали, описували наявні ознаки пошкоджуючої дії патогена та відбирали алантоїсну рідину для подальшого дослідження в РГА. Після закінчення терміну інкубації, навіть за відсутності випадків загибелі, ембріони розтинали, відбирали алантоїсну рідину, гемаглютинуючу активність якої визначали у реакції гемаглютинації з 1%-ю суспензією еритроцитів півня. У разі відсутності позитивної реакції в РГА додатково проводили 3?5 “сліпих” пасажів.

З матеріалу, відібраного в місцях скупчення диких птахів у системіоз. Сиваш, проводили ізоляцію, остаточну ідентифікацію та молекулярно-генетичну оцінку вірусу пташиного грипу. Матеріалом для досліджень були проби (по 5 зразків кожного обєкта) ? пеленгас (Mugil soiuy), креветка (родина Сrangon), личинка комах (родина Chironomida - мотиль) та мул, що відібрані в різних ділянках північно-західної акваторії Азовського моря (оз. Сиваш - Кризамі, Костін Шпиль та Любимівка). Геномну РНК для ПЛР-аналізу виділяли гуанідін тіоціонатним методом (Chomczynski P. and Sacchi N., 1989).

Аналіз проводили за допомогою діагностичної тест-системи “Птах-Грип-ПЛР-РЧ” для виявлення РНК вірусу пташиного грипу А/H₅N₁ методом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу, ТУ 24.4-23524007-064-2006, серія 001/AIV/RG-100, згідно з настановою з використання діагностичного набору. Кожен зразок досліджували у двох повторах. Ампліфікацію у реальному часі проводили в реактивній суміші обємом
25 мкл. Ампліфікацію кДНК мішені здійснювали на приладі Rotor-Gene 3000, Corbett research (Австралія), з таким температурним профілем: активація урацил-ДНК-глікозидази - 5 хв при +50 °С, активація ДНК-полімерази - 10 хв при +94 °С та наступні 40 циклів ампліфікації, які включали денатурацію - 30 с при +94 °С, відпал праймерів - 30 с при +58 °С, елонгацію - 30 с при +72 °С. Аналіз результатів здійснювали за допомогою програмного забезпечення RG operating software, version 6.0.33.

Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3,1”, згідно з інструкціями виробника. ПЛР-продукти клонували у бактеріальний вектор pBluescript II SK+(Stratagene) за загальноприйнятими методами генної інженерії (Sambrook J. et al., 1989). Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3.1”, згідно з інструкціями виробника. Компютерний аналіз даних проводили з використанням пакета програм Vector NTA v. 9.1 (Invitrogen) та Інтернет-ресурсів: BLAST, ClustalW, WebPhylip.

У частині дослідів вивчали морфофункціональні зміни у риб при експериментальному заражені ізолятом “A(chironomida) Azov/11/2006(H₅N₁)” вірусу грипу птахів. Зараження однорічок коропа (Carpio carpio) здійснювали через інєкцію в черевну порожнину вірусовмістимої алантоїсної рідини курячих ембріонів та матеріалу, одержаного із мотиля з титрами в РЗГА 1:64 та в РГА 1:256. Однорічним коропам двох експериментально заражених груп (в кожній по 15 риб) уводили внутрішньочеревно 0,1 та 0,2 см³ ізоляту “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H₅N₁)” вірусу грипу птахів, а одній контрольній групі (15 риб) вводили розчин Рінгера. Риб витримували в окремих 10-літрових акваріумах з постійною аерацією та температурою +20±1 єС. З початку досліду кожні 24 години протягом перших 3 діб відбирали з кожної групи по 3 екземпляри, в яких брали кров із серця. Інших коропів досліджували на 5 та 10 добу. З тулуба коропів готували гомогенати, які зберігали при температурі +8±2 єС. З крові одержували сироватку, в якій визначали вміст білка (Loury et al., 1951), білкові фракції (альбумін, глобулін) турбодемитричним методом та активність лізоциму дифузним методом на агарі (Лабінська А.С., 1978). У коропів дослідних та контрольної груп визначали масу, довжину, коефіцієнт вгодованості за Фультоном, абсолютну (мг) та відносну (індекс ‰) масу імунокомпетентних органів (гепатопанкреас, нирка та селезінка). З імунокомпетентних органів виготовляли екстракти тканин (1:50), в яких визначали вміст водорозчинного білка та активного лізоциму. Проводили підрахунок кількості еритроцитів та лейкоцитів у десяти полях зору мікроскопа (при збільшенні ? 60Ч7) з одного мазка крові риб та визначали співвідношення кількості лейкоцитів (Л) до кількості еритроцитів (Е) у полі зору ? Е/Л (Кушманова О.Д., Івченко Г.М., 1978; Строев Е.А., Макарова П.П., 1986). Через 10 діб у риб дослідної та контрольної груп визначали лізоцим та бактерицидну активність сироватки крові (БАСК) (Смирнова А.В., Кузьмина Г.А., 1966).

В експерименті з вивчення пявки як можливого компоненту резервуара збудника використали 30 медичних пявок (Hirudo medicinalis). Зараження проводили алантоїсною рідиною з інфікованих штамом “A(chironomida) Azov/11/2006(H₅N₁)” 10-добових курячих ембріонів. Було сформовано 8 дослідних та 2 контрольні групи пявок (по 3 екземпляри в кожній). Восьми дослідним групам пявок внутрішньоцеломно вводили алантоїсну рідину, що містила вірус пташиного грипу в кількості 10^8,45 ЕЛД_50/0,1см³ , 10^7,45 ЕЛД_50/0,1см³, 10^6,45 ЕЛД_50/0,1см³ і 10^5,45 ЕЛД_50/0,1см³ відповідно. Пявкам контрольної групи вводили стерильний 0,9 %-й розчин NaCl. Доза введення 0,125 см³. Пявок утримували у флаконах з водою обємом 400 см³, закритих гумовими пробками з отворами. Через 5 та 45 діб після початку експерименту пявок заморожували, потім розморожували і готували суспензію на стерильному фізіологічному розчині та досліджували методом ПЛР на наявність РНК вірусу пташиного грипу.

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятою методикою (Плохинський М.А., 1980), використовуючи компютерну програму Microsoft Office EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Наявність домашніх птахів на птахофабриках АР Крим та коротка характеристика місць мешкання диких птахів, рекомендованих Європейською комісією для дослідження на пташиний грип. Створені нами карти-схеми наявності поголівя птахів на птахофабриках АР Крим та спеціалізації птахогосподарств України свідчать, що значна кількість поголівя птахів утримується на промислових птахофабриках. Масові сезонні міграції пернатих сприяють виникненню безпосередніх контактів між дикими та домашніми птахами. Порушення технології вирощування птахів на промислових підприємствах може також зумовити контакти диких та синантропних птахів з промисловими. Дикі та синантропні птахи можуть бути джерелом та резервуаром збудника пташиного грипу для домашніх і промислових птахів. Європейською комісією рекомендований перелік диких та синантропних видів птахів, які можуть бути носіями вірусу грипу. Відповідно до переліку ми проаналізували наявність перелітних видів птахів у АР Крим. Нами наведена стисла характеристика довкілля, біології та місць проживання диких птахів на півдні України. Описані представники 7 родин (25 видів) перелітних та зимуючих диких птахів, зареєстрованих у районі оз. Сиваш (Костин А.В., 1983; Андрущенко А.Н. и соавт., 1999). Із наведених видів птахів найбільш поширені озерна чайка - 80 000 екз., крижень - 62 300 екз., чирок-тріскунок - 51 896 екз., поганка - 50 438 екз., великий баклан - 29 000 екз., червоноголова чернь - 18 018 екз., біла чапля - 15 225 екз., основним кормом яких є рачки, личинки комах, молюски і риби (бички, тарань, карась, сазан). У значно меншій кількості (500-2000 екз.) у Криму зустрічаються такі перелітні та зимуючі птахи: чирок-свистунок, широконоска, чибіс, турухтан, чернь чубатий, лебідь-шипун, звичайний шпак, у кормі яких наявні тваринні та рослинні компоненти. Чисельність інших птахів у оз. Сиваш коливається від 200 до 500 екз. (білий лелека - 201, білолобий гусак - 250, сіра качка - 479, свищ - 360, перепілка - 300, деркач - 300, чорноголовий хохотун - 478, грак - 300).

Наведений перелік птахів свідчить про їх надзвичайне видове різноманіття, сконцентроване на відносно обмеженій території, що забезпечує можливість тісного міжвидового контакту та створює умови для тривалої циркуляції й пасажування різноманітних патогенів, зокрема збудника пташиного грипу. Види диких птахів, що годуються водними мешканцями, слід досліджувати при аналізі зон підвищеного ризику, повязаного з неблагополуччям з пташиного грипу.

Ураження птахів різних видів вірусом грипу в регіонах України. Моніторингові дослідження на грип птахів в Україні почали проводити з 2003 року. В 2003 році було досліджено в РЗГА 3700 сироваток крові птахів, із них виявлено серопозитивних (до гемаглютиніну Н₆): всього 3 голови у Херсонській області. В 2004 році було досліджено 20513 птахів різних видів і категорій. При цьому антитіла були виявлені до Н₂ та Н₆ в 107 пробах сироваток крові. В 2005 році було досліджено 91861 голів. Антитіла були виявлені в 148 пробах сироватки крові. При цьому у 18 пробах виявлено антитіла до H₅, а в інших пробах - до H₂ та H₉. В 2006 році було досліджено на грип 307024 проби, в т.ч. диких птахів - 17104, синантропних птахів - 15890, птахів приватного сектору - 168274 та птахів у птахогосподарствах - 105756 проб. У першому півріччі 2007 року досліджено 144967 проб сироватки крові і виявлено 31 серопозитивну пробу до H₂ та H₉ в АР Крим, Полтавській, Харківській, Херсонській, Тернопільській та Черкаській областях.

Серед водоплавних птахів різних видів провідне місце за кількістю та різноманітністю ізольованих вірусів грипу посідають птахи підряду гусеподібних. Але сприйнятливість птахів різних видів одного ряду до вірусів грипу може відрізнятися. В екологічному відношенні серед диких видів птахів, від яких були ізольовані віруси грипу, домінують види, що надають перевагу водним та навколоводним місцям проживання (дикі гуси, дикі качки, лиски, баклани). Птахи виду дрозд роблять гнізда в сухих рівнинних місцях, а вид павичі - в місцях проживання, без обовязкової наявності великих водойм. Можна припустити, що таксономічна та екологічна гетерогенність диких птахів, які є носієм вірусу грипу на території України, пояснюється наявністю великої кількості водойм, які придатні для гніздування птахів. Очевидно, гетерогенність диких птахів може бути дуже сприятливою умовою для реасортації геномів різних штамів вірусу грипу.

Вивчення антигенної структури високопатогенного штаму вірусу грипу Н₅N₁, виділеного в період епізоотії хвороби у 2005-2006 роках. На півдні України епізоотичний спалах високопатогенного пташиного грипу (ВППГ) був зареєстрований у листопаді 2005 р. у господарствах приватного сектору серед курей, індиків, качок та гусей. Аналіз патологічного матеріалу показав, що ізолят збудника, виділеного в Криму “А/chiken/Crimea/1/2005(H₅N₁)”, що викликав епізоотію, споріднений вірусу А H₅N₁, який був виділений раніше від хворих птахів у Росії, Китаї та Монголії. За геном гемаглютиніну спорідненість їх становила від 99,2 до 99,8 %, а за геном нейромінідази - від 99,5 до 99,7 %.

Результати досліджень патологічного матеріалу від хворих птахів із Криму в референтних ветеринарних лабораторіях VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральної державної установи “Федеральний центр охорони здоровя тварин” (Володимир, Росія) і Федеральної державної установи “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія) підтвердили наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу (ВПВПГ) H₅N₁, який зумовив епізоотію у цей період (табл. 1).

Таблиця 1 - Дослідження на високопатогенний грип птахів

Подальші спалахи ВППГ (до 16.07.2006 р.) серед приватних та диких птахів у Одеській, Херсонській, Сумській областях, а також у м. Феодосія, діагноз хвороби яких контролювався референтними лабораторіями, засвідчив про циркуляцію раніше виділеного штаму “А/chiken/Crimea/1/2005 (H₅N₁)”.

Молекулярно-генетичними дослідженнями не було виявлено мутантів цього штаму вірусу, які містили б комплементарні до епітелію людини рецептори, а також тих, що були резистентні до лікувальних препаратів (ремантодину, амантодину та озельтамівіру).

Одержані дані дозволили створити карту-схему поширення високопатогенного грипу птахів територією України за період 2005-2006 рр. (рис. 1).

На карті зазначені епізоотичні вогнища високопатогенного пташиного грипу, які були виявлені в АР Крим, Одеській, Херсонській та Сумській областях.

Молекулярно-генетичний аналіз вірусу пташиного грипу, виділеного із системи оз. Сиваш. У листопаді 2006 - квітні 2007 року нами були здійснені експедиційні виїзди та відбір проб матеріалу (мотиль, мул, креветки, пеленгас) з місць, де спостерігалось захворювання диких птахів у травні 2006 року. Вищезазначені проби досліджували у ПЛР у реальному часі і проби, у яких ПЛР давала позитивний результат, були використані для зараження та проведення трьох пасажів на курячих ембріонах. Результати проведених досліджень матеріалу на наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу А H₅N₁ наведені в табл. 2. З неї видно, що спостерігалась загибель курячих ембріонів, які були заражені пробами патологічного матеріалу від мотиля, алантоїсна рідина яких виявилась позитивною в ПЛР (А/H₅N₁). При дослідженні в ПЛР позитивними також виявились проби зразків із пеленгаса та мулу, а проби із креветок дали негативний результат.

Фрагменти ПЛР позитивного зразка від мотиля клонували у плазмідний вектор та визначали їх нуклеотидну послідовність. На підставі трьох сіквенсів ізоляту пташиного грипу був проведений філогенетичний аналіз. У подальшому, використовуючи веб-браузер BLAST-P, проведено пошук по базах даних GenBank, EMBL, BDBI та PDB, найбільш споріднених до визначеного нами фрагмента вірусу пташиного грипу, амінокислотних послідовностей інших ізолятів вірусу.

Таблиця 2 - Дослідження матеріалу із ставів оз. Сиваш на наявність вірусу високопатогенного грипу H₅N₁

Примітки: 1. У цій та наступних таблицях: (+) - позитивний результат дослідження; (-) - негативний результат дослідження;

2. НД - матеріал не досліджували.

На підставі одержаних результатів були побудовані філогенетичні дерева і встановлено наявність нового ізоляту штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)”. Зясувалось, що цитопатична дія нового штаму (визначали шляхом зараження моношарових культур фібробластів ембріонів курей) проявлялась через 48 годин та завершувалась впродовж 72-х годин. Титр вірусовмістимої рідини штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)” на культурі курячих фібробластів становив 10^5,9ЦПД _50/0,1см³, а на курячих ембріонах ? 10^8,45ЕЛД _50/0,1см³.

Зміни гістоструктури курячих ембріонів, заражених вірусом грипу штаму “А(chironomida)Azov/11/2006/(H₅N₁)”. Встановлено, що виділений нами штам “А(chironomida)Asov/11/2006 /(H₅N₁)” у трьох проведених пасажах на курячих ембріонах проявляє цитопатогенну дію і зумовлює загибель ембріонів через 48 годин. Патогенна дія у ембріонів проявляється ураженнями головного та спинного мозку, мозкових оболонок, що формуються, та ендотелію кровоносних судин, які мають запальний характер. Також відмічається розвиток жирової дистрофії гепатоцитів та зернистої дистрофії нефроцитів.

Одержані результати прояву патогенної дії підтверджують належність цього штаму до високопатогенного вірусу грипу птахів.

Морфофункціональні зміни в організмі риб, заражених вірусом грипу штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)”. Після введення коропам у черевну порожнину вірусовмістимого матеріалу, відібраного від мотиля, впродовж всього досліду загибелі риб не реєстрували, а також були відсутні клінічні та патолого-анатомічні ознаки захворювання (табл. 3).

Таблиця 3 - Виявлення присутності вірусу та визначення вірусної активності в гомогенатах тіла коропів

Зразками гомогенатів від позитивних у ПЛР риб були заражені 10-добові курячі ембріони. Загибель курячих ембріонів реєструвалась через 3 доби. Після утримання інфікованих риб і подальшому відборі з них через 5?10 діб патологічного матеріалу та його інокуляції не відмічали загибелі ембріонів, і не було встановлено наявність вірусу за допомогою ПЛР. Як видно з табл. 3, в організмі коропа патогенний вірус грипу птахів зберігався протягом 3-х діб.

За період проведення експериментів (10 діб) не спостерігалось достовірного зниження маси, довжини, вгодованості, морфологічних та біохімічних показників крові (еритроцити, лейкоцити, вміст білка та лізоциму в сироватці) в дослідних групах риб порівняно з контрольними особинами. Той факт, що в організмі риб достовірно (Р<0,05) підвищилися бактеріцидна активність сироватки крові та вміст лізоциму у відповідь на інокуляцію вірусу, свідчить про їх стійкість до цього патогену. Очевидно, риби можуть бути резервуаром збудника пташиного грипу та брати участь у формуванні водних природних вогнищ цієї хвороби.

Медична пявка - можливий резервуар та біотранспортер вірусу грипу птахів. Нами встановлено, що вірус пташиного грипу, інокульований у пявку, здатний зберігатись у ній впродовж 45 діб та проявляти високу патогенність. Зниження інфекційної активності та виживання вірусу пташиного грипу залежить від його концентрації та часу перебування в організмі пявки (табл. 4).

Таблиця 4 - Експериментальне зараження медичної пявки вірусом пташиного грипу та курячих ембріонів

Так, через 5 діб після інокуляції вірусної суспензії в титрах 10^8,45 ЕЛД_50/0,1см³ , та в розведені 1:10 (10^7,45 ЕЛД_50/0,1см³), 1:100 (10^6,45 ЕЛД_50/0,1см³) та 1:1000 (10^5,45 ЕЛД_50/0,1см³) відповідно спостерігали загибель курячих ембріонів на 2-3 добу. В розчині 1:1000 хоч і була виявлена позитивна ПЛР, але не відбувалось загибелі курячих ембріонів. Через 45 діб суспензії пявок викликали загибель курячих ембріонів на 3-ю добу (нерозведений та розведений 1:10 матеріал відповідно).

Таким чином, виділено новий високопатогенний штам “А(chironomida) Azov/11/2006/(H₅N₁)”, який викликає загибель курячих ембріонів через 48 годин, а також зумовлює ЦПД у культурі курячих фібробластів. Цей штам до 3-х діб зберігається в організмі риб і до 45 діб - в організмі пявок, не втрачаючи вірулентності, його було депоновано нами в ДНКІ БШМ з метою використання при створенні сучасних засобів діагностики та профілактики високопатогенного грипу птахів.

Розробка інтегральної системи контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. Розроблена і впроваджена електронна інтегральна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. В її основу було покладено результати наших власних досліджень і спостережень, а також результати аналізу відповідних літературних повідомлень щодо проблеми ортоміксовірусної інфекцій в гуманній і ветеринарній медицині. При розробці та організації протиепізоотичних заходів проти грипу птахів слід розрізняти епізоотичний осередок, неблагополучний пункт, зону загрози і зону нагляду. Глибина зони нагляду становить не менше 10 км від меж неблагополучного пункту. Розроблена нами інтегральна електронна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні дозволяє в будь-який час визначити межі епізоотичного вогнища, межі неблагополучного пункту, зону загрози, зону спостереження та проводити в них належні заходи діагностики, ...........