2

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОУ ВПО «КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Химический факультет

Кафедра аналитической химии

Постановка методики определения таурина с целью изучения обменных процессов в мягких контактных линзах

(дипломная работа)

Научный руководитель:

к.х.н., доцент

Шрайбман Г.Н. ______

«___»_________2007 г.

Научный консультант:

вед. инженер

Дикунова Т.В. _______

«___»_________2007 г.

Дипломник:

Ватрушкина А.В. _____

«___»_________2007 г.

КЕМЕРОВО 2007

РЕФЕРАТ

В настоящей работе представлены результаты исследования обменных свойств мягких контактных линз (МКЛ) на основе материала «Кемерон-1» по отношению к широко применяемому в офтальмотерапии лекарственному средству «Тауфон» (4% водный раствор таурина).

Для проведения исследования в качестве достаточно чувствительного метода выбран спектрофотометрический метод с использованием реакции с нингидрином. Метод основан на образовании красителя фиолетового Руэмана с максимумом в спектре поглощения при длине волны 570 нм. В работе установлены условия, при которых фотометрическая реакция приводит к образованию воспроизводимой и стабильной окраски продукта: растворитель нингидрина - этилцеллозольв, стабилизатор окраски - этиловый спирт (соотношение в смеси реагентов 1:1); буферный раствор с рН 6,2; температура реакции 100єС; время нагревания 10 минут. Экспериментальное значение молярного коэффициента поглощения при этом составляет (8170480) М-1·см-1. Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций (0,657,0)·10-5 М.

Предел обнаружения таурина сmin=4,20·10-6М(5,25·10-4мг/мл); Sr не более 5 %.

Отработанная методика использовались при исследовании сорбции и десорбции таурина из МКЛ. Было установлено, что насыщение МКЛ таурином достигается к 3 часам. Степень десорбции таурина уменьшается с увеличением степени сорбции до ~40 %, причем более 50% поглощенного таурина десорбируется за первые 30 минут.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности пролонгированного введения препарата в ткани глаза с использованием МКЛ из материала «Кемерон-1» в качестве транспортного средства.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. Литературный обзор

1.1. Свойства таурина

1.1.1 Химические и физические свойства

1.1.2 Биологическая роль таурина

1.1.3 Названия препаратов с действующим веществом таурин*(тaurine*)

1.2. Методы определения аминокислот

1.2.1 Метод кислотно-основного титрования

1.2.2 Анализ аминокислот методом тонкослойной хроматографии

1.2.3 Электрохимические методы определения аминонокислот

1.2.4 Фотометрические методы

1.3 Мягкие контактные линзы

1.3.1 Основные характеристики мягких контактных линз

1.3.2 Применение МКЛ

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1 Объект исследования

2.2 Реактивы и аппаратура, используемые в работе

2.3 Методики исследования

2.3.1 Методики определения таурина

2.3.2 Методика определения сорбции и десорбции таурина

2.4 Обработка результатов анализа

3. Результаты эксперимента и их обсуждение

3.1 Изучение условий проведения фотометрической реакции таурина с нингидрином

3.2 Характеристики градуировочной зависимости для определения

таурина в выбранных условиях

3.3 Результаты исследования обменных свойств МКЛ и их обсуждение

3.3.1 Результаты исследования сорбции таурина

3.3.2 Результаты изучения десорбции таурина

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

приложение

ВВЕДЕНИЕ

Мягкие контактные линзы (МКЛ) были созданы чехословацкими учеными Вихтерле и Лимом в 1960 году. Это послужило началом использования линз в лечении некоторых заболеваний глаза в качестве искусственной повязки для роговицы и средства введения лекарственных веществ в глаз. Однако если применение МКЛ с бандажной целью уже вошло в практику офтальмологов, то вопросы, связанные с введением лекарственных веществ в глаз с помощью линз, находятся в стадии разработки. Известно, что МКЛ, пропитанные лекарственными веществами, продлевают их лечебное действие и вследствие этого являются более эффективным методом введения препаратов в глаз по сравнению с инстилляционным. Время действия препарата, вводимого в глаз с помощью МКЛ, различно и определяется химическим строением молекулы препарата и природой материала линз. Лечебный эффект, в свою очередь зависит от свойств материала линз, таких, как кислородопроницаемость, влагосодержание и др., и геометрических параметров линз.

Для изготовления МКЛ применяются полимерные материалы на основе гидрогелей. Линзы из этих материалов, наряду с хорошими оптическими свойствами (прозрачность, стабильность показателя преломления) обладают гибкостью, эластичностью, биологической инертностью. В настоящее время существует более 150 видов материалов для МКЛ. В проблемной научно-исследовательской лаборатории высокомолекулярных соединений КемГУ создан материал «Кемерон-1», который обладает выше указанными свойствами и применяется для изготовления мягких контактных линз, используемых в бандажных целях.

Возможность применения МКЛ в качестве средства для введения лекарственных веществ в орган зрения зависит от абсорбции (поглощения) данного вещества материалом линзы и последующей десорбции. Одним из широко используемых лекарственных терапевтических средств являются глазные капли «Тауфон», отпускаемые без рецепта врача. При9меняется «Тауфон» при лечении помутнения хрусталика - катаракты (старческой, диабетической, травматической, лучевой); для лечения дистрофических поражений сетчатой оболочки глаза, в том числе, наследственных дегенераций; физической травмы роговицы, глаукомы, сердечно-сосудистой недостаточности различной этиологии. «Тауфон» представляет собой 4% водный раствор таурина - 2-аминоэтансульфоновой кислоты. Для определения таурина в препарате достаточно чувствительности титриметрического анализа - метода кислотно-основного титрования с блокированием аминогруппы формальдегидом. При изучении процессов сорбции-десорбции вещества гидрогелем МКЛ необходим более чувствительный метод. Рассмотрение литературных данных позволило выбрать спектрофотометрический метод, основанный на реакции с нингидрином. Поскольку конкретной методики для определения таурина не было найдено, возникла необходимость ее разработки на основе известных условий проведения реакции с нингидрином родственных веществ.

Целью работы является изучение обменных свойств МКЛ на основе материала «Кемерон-1» по отношению к таурину - действующему веществу глазных капель «Тауфон».

Задачи дипломной работы:

1) поиск и отработка условий проведения нингидриновой реакции с таурином и установление метрологических характеристик фотометрической методики определения таурина;

2) изучение сорбции и десорбции таурина образцами МКЛ с использованием фотометрической методики.

1. Литературный обзор

1.1. Свойства таурина

Таурин - жизненно необходимая серосодержащая аминокислота, обладающая широким спектром фармакологического действия. Как своеобразная аминокислота, таурин представляет интерес с химической и с биологической точки зрения. С одной стороны, это производное аминокислоты, так как в нём есть кислотная и аминогруппы. С другой стороны, таурин является аминосульфоновой кислотой, и, в отличие от б-аминокарбоновых кислот (точнее, замещённых аминоуксусных кислот), являющихся структурными единицами белков и множества других аминокарбоновых кислот, обладает особыми свойствами. В связи с этим определение таурина, как аминокислоты вызывает некоторые затруднения.

1.1.1 Химические и физические свойства

Таурин: pN - Cp - Cp - SO3H (2-аминоэтансульфоновая кислота)

Молекулярная масса..……...………………………………….…….125,15

Температура плавления (разложения),°С…...…...…….…….…..321-323

Плотность, г/см3……………………………………………………....1,734

Молекула таурина содержит кислую сульфогруппу SO3H (рКа =1,5) и основную аминогруппу Np (рКа = 9,06), изоэлектрическая точка в водных растворах составляет 5,12. В физиологических условиях (рН = 7,4) степень ионизации сульфогруппы составляет 100%, аминогруппы -- 96,3%, то есть таурин в таких условиях практически полностью существует в виде цвиттер-иона [1].

Таурин белый бесцветный кристаллический порошок, без запаха; кристаллы-игольчатые, плавится с разложением. Хорошо растворимый в воде (10,5г/100 мл при 25°С, прозрачный бесцветный раствор) и практически нерастворимый в 95% этиловом спирте, эфире, ацетоне и хлороформе; устойчив к кипящим кислотам и даже к царской водке. Это указывает на то, что таурин существует в виде биполярного иона: pN+--(Cp)2--SO3- [2,3]. Таурин растворяется в крепкой pSO4 и HNO3. Азотистая кислота при действии на таурин дает изотионовую кислоту. Таурин соединяется с основаниями, давая ряд ее прочных солей. Известны соли натрия, кальция, кадмия, свинца, серебра. Они получаются при растворении основания в растворе таурина. Таурин относится к малотоксичным веществам [3].

Синтез таурина был произведен Кольбе [4], который смешивал измельченный изотионовокислый калий с пятихлористым фосфором. Наиболее употребимый способ получения таурина из бычьей желчи. В промышленности таурин получают из оксирана, нуклеофильно расщепляя гетероцикл действием гидросульфита натрия.

1.1.2 Биологическая роль таурина

Таурин или амидоэтиленсульфоновая кислота C2H7NSO3, название происходит от лат. taurus (бык), был открыт Леопольдом Гмелином в 1826 г. как продукт разложения находящейся в бычьей желчи таурохолевой кислоты. Анализ таурина был произведен Демарсэ, а позднее Редтенбахером, который открыл в нем присутствие серы. Таурин находится в желчи многих животных, в мышцах моллюсков, в легких быка, в печени, селезенке и почках ската [4]. В организме образуется при ферментативном окислении сульфгидрильной группы SH цистеина с участием цистеиндеоксигеназы и последующим декарбоксилированием. Таурин образует в печени конъюгаты с желчными кислотами (ацилируясь ими по аминогруппе), образовавшиеся конъюгаты (например, таурохолевая и тауродезоксихолевая кислоты) входят в состав желчи, и, будучи поверхностно-активными веществами, способствуют эмульгированию жиров в кишечнике.

Таурин является естественным продуктом обмена серосодержащих аминокислот: цистеина, цистеамина, метионина. Таурин - жизненно необходимая сульфоаминокислота, которая была найдена практически у всех видов животных. В растительном мире это вещество не встречается. Исключение составляют красные водоросли. Благоприятное лечебное действие оказывает при кардиоваскулярных заболеваниях, гликозидных интоксикациях, гиперхолестеринемии, эпилепсии, диабете, болезни Альцгеймера, при заболеваниях печени, алкоголизме, цистофиброзе, пострадиационном поражении, ретинопатии. После родов концентрация его в материнском молоке достигает больших значений. Предназначенную природой первую порцию таурина младенец получает с молоком матери. Таурин необходим для нормального развития центральной нервной системы и мышц. Характерной особенностью таурина является способность стимулировать репаративные процессы при дистрофических нарушениях сетчатки глаза, травматических поражениях тканей глаз. Таурин необходим для сетчатки глаза. На свету сетчатка теряет таурин, ночью он накапливается. Потеря 50% таурина от нормальной концентрации - необратимый процесс, приводящий к слепоте. Абсолютного дефицита таурина у человека не бывает. Какое-то количество его образуется в организме в процессе превращения. Но, в основном, мы получаем это вещество с животными продуктами (с молоком, мясом, рыбой). Большие концентрации таурина содержат морские животные. Существуют ситуации, при которых необходимо потреблять дополнительное количество таурина, когда организму нужна помощь. Так, например, критическим является момент, когда миокард теряет таурин и одновременно понижается его концентрация в крови. В эксперименте такие животные не выживают. У человека риск развития подобных событий может возникнуть при сердечной недостаточности или облучении большими дозами радиации. Дефицит таурина в организме наблюдается также при сахарном диабете. Приём таурина в таких случаях позволяет стабилизировать течение болезни, избежать неблагоприятного исхода и увеличить продолжительность жизни. Таурин теряется при стрессах, хирургических операциях, ишемических состояниях (кислородной недостаточности). При недостатке таурина страдает сердце, печень, белые клетки крови. В старости скорость выведения таурина увеличена. Избыточное выведение таурина из организма встречается при различных состояниях и нарушениях обмена. Аритмии, нарушения процессов образования тромбоцитов, кандидозы, физический или эмоциональный стресс, заболевания кишечника, дефицит цинка и злоупотребление алкоголем приводят к дефициту таурина в организме. Злоупотребление алкоголем к тому же нарушает способность организма усваивать таурин. Для того чтобы избежать дефицита таурина необходимо его восполнять. Чтобы проявить себя при столь широком спектре заболеваний, таурин должен затрагивать процессы или клеточные структуры, которые являются принципиально важными для физиологической активности органов и тканей, страдающих при перечисленных патологиях. Таурин необходим для нормального обмена натрия, калия, кальция и магния. Он предотвращает выведение калия из сердечной мышцы и потому способствует профилактике некоторых нарушений сердечного ритма. Таурин оказывает защитное действие на головной мозг, особенно при дегидратации. Его применяют при лечении беспокойства и возбуждения, эпилепсии, гиперактивности, судорог. Концентрация таурина в головном мозге у детей в четыре раза больше, чем у взрослых. Биологически активные пищевые добавки с таурином дают детям с синдромом Дауна и мышечной дистрофией. В некоторых клиниках эту аминокислоту включают в комплексную терапию рака молочной железы [2,5].

В последнее время установлено, что в мозге таурин играет роль нейромедиаторной аминокислоты, тормозящей синоптическую передачу, обладает противосудорожной активностью, оказывает также кардиотропное действие.

Таурин используется в медицине и пищевой промышленности, но в последние годы стал обычным компонентом для напитков (тоники), соков. Используется как биологически активная добавка (БАД), а также добавляется в корма для животных, особенно - для кошек. Таурин часто вводят в состав комплексных лекарственных препаратов, БАД. Он является основным действующим веществом препарата «Тауфон».

Основные физиологические функции таурина:

Таурин в составе таурохолевых (желчных) кислот необходим для всасывания липидов и жирорастворимых витаминов в кишечнике. В свободном виде он необходим для нормальной физиологической активности любой клетки организма.

Таурин защищает клетку от сморщивания, если состав электролитов во внеклеточной среде выше нормы, и от набухания, если концентрация электролитов ниже нормы.

Таурин регулирует внутриклеточный кальций. Он понижает концентрацию Са2+, предотвращая некротические изменения при избытке этого иона, и повышает Са2+, если уровень кальция в клетке ниже нормы и его не хватает для физиологической активности.

Таурин защищает клеточную мембрану, регулируя её состав и жёсткость.

Таурин участвует в воспалительных ответах организма и, крайне необходим для защиты клеток крови. Он обладает детоксикационными свойствами, нейтрализует сильный окислитель гипохлорную кислоту, которая генерируется при окислительном взрыве нейтрофилов (как известно, эти клетки участвуют в иммунном ответе).

1.1.3 Названия препаратов с действующим веществом таурин* (тaurine*)

Дибикор (Dibicoram); Тауфон - АКОС (Tauranumx - AKOS); Тауфорин раствор 4%; Таурин (Taurin); Тауфона раствор 4% (глазные капли) (Solutio Таufoni 4%); Тауфон (Taufonum); Тауфона таблетки (Tabulettae Taufoni).

Препарат «Тауфон»

Латинское название: Taufonum (2-Аминоэтансульфоновая кислота).

Фармакологические группы: Белки и аминокислоты. Другие метаболики. Действующее вещество (международное непатентованное название) таурин* (тaurine*).

Фармакологические свойства: Тауфон относится к аминокислотным препаратам, стимулирующим репаративные и регенеративные процессы при заболеваниях сетчатки глаза дистрофического характера, травматических повреждениях тканей последнего, патологических процессах, сопровождающихся резким нарушением метаболизма этих тканей. Как серосодержащая аминокислота препарат способствует нормализации функций клеточных мембран, оптимизации энергетических и обменных процессов, поддержанию постоянства электролитного состава цитоплазмы клеток, торможению синоптической передачи.

Применение: Дистрофические поражения сетчатой оболочки глаза, в том числе наследственные тапеторетинальные дегенерации, дистрофии роговицы, катаракта, травмы роговицы, открытоугольная глаукома, сердечно-сосудистая недостаточность различной этиологии (в том числе на фоне интоксикации сердечными гликозидами). Также назначается при лечении органа зрения совместно с другими препаратами.

Противопоказания: Повышенная индивидуальная чувствительность к препарату.

Побочные действия: Аллергические реакции.

Форма выпуска: Для медицинского применения таурин выпускается в виде 4% водного раствора под названием «Тауфон» во флаконах из бесцветного стекла по 5 мл или 10 мл и в ампулах по 1 мл. Хранение: в прохладном, защищенном от света месте. 10 мл препарата содержат 0,4 г таурина. Этот препарат выбран нами для исследований, потому что отпускается без рецепта врача. Используется в виде бесцветного прозрачного стерильного раствора с рН 5-6,5.

1.2 Методы определения аминокислот

Поскольку таурин часто рассматривают в ряду аминокислот, в нейтральной среде он существует в виде цвиттер-иона. Поэтому для его определения целесообразно рассмотреть методы анализа аминокислот.

В настоящее время разделение и определение аминокислот в различных биологических объектах является важной задачей клинической биохимии и аналитической химии. В связи с этим быстро развиваются методы анализа аминокислот и их смесей. К таким методам относятся: метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным или электрохимическим детектированием [6,7] (способы пред- и постколоночной дериватизации аминокислот), реакция с о-фталевым альдегидом в присутствии нуклеофильных агентов, которую широко используют для чувствительного электрохимического, спектрометрического и флуориметрическое анализа аминокислот [8], метод капиллярного электрофореза [9], метод алкалиметрического титрования [10,11] и др.

В ВЭЖХ аминокислоты определяют с использованием различных детекторов: УФ, лазерного флуориметрического (ЛИФ), электрохимического, а также рефрактометрического. Все методы детектирования, кроме последнего, требуют предварительной процедуры дериватизации. Для получения производных аминокислот с целью их последующего определения используют такие соединения, как о-фталевый альдегид, фенил-изотиоцианат (УФ-детектирование), флуоресцеин-изотиоцианат, флуоресцамин (ЛИФ-детектирование).

Серосодержащие аминокислоты обычно определяют методами хроматографии [12], потенциометрии, а также иодометрическим титрованием. Среди электрохимических методов анализа для определения серосодержащих аминокислот широко применяют вольтамперометрию [13,14,15].

Аминокислоты и пептиды можно легко обнаружить методом хроматографии на бумаге или в тонком слое целлюлозы, используя небольшие количества материала. Бумажная и тонкослойная хроматография чаще используются для качественного анализа. Для определения используются различные буферы и органические растворители, при использовании которых достигается разделение аминокислот при одномерном фракционировании. Не разделенные аминокислоты могут быть разделены в результате проведения хроматографии при других pH во втором (перпендикулярном) направлении. Среди реагентов дающих широкий диапазон цветов при взаимодействии с аминокислотами можно отметить: нингидрин, флуоресцамин, изатин. Аминогруппы могут реагировать со свободными альдегидными группами, содержащимися в бумаге. Образующиеся основания Шиффа дают синюю флуоресценцию в УФ-свете. Йод не вызывает разрушения аминокислот. Хлор пригоден для определения N-блокируемых аминокислот [2]. Быстро развивается лигандообменный хроматографический анализ аминокислот и пептидов на силикагельных сорбентах в присутствии ионов меди.

1.2.1 Метод кислотно-основного титрования

Методы кислотно-основного титрования [10,11] основаны на использовании реакции между кислотами и основаниями. Алкалиметрическое титрование (щелочами) применяют для определения сильных и слабых кислот, кислых солей, солей слабых оснований и органических соединений, обладающих кислыми свойствами (кислоты, фенолы). Органические (слабые) кислоты способны оттитровываться раствором NaOH, причем образующийся анион кислоты вступает в реакцию гидролиза, и среда становится щелочной:

RCOOH + OH- Н2O + RCOO-.

Таурин, вследствие амфотерного характера не удается непосредственно титровать раствором щелочи. Титрование оказывается возможным, если блокировать аминогруппу действием формальдегида:

pN--(Cp)2--SO3OH + CpO = Cp=N--(Cp)2--SO3H + Н2O.

Образующееся соединение можно титровать алкалиметрически с индикатором фенолфталеином в соответствии с уравнением реакции [5]:

Cp=N--(Cp)2--SO3H + NaOH Cp=N--(Cp)2--SO3Na + Н2O.

1.2.2 Анализ аминокислот методом тонкослойной хроматографии

Разработка методов количественного и качественного анализов аминокислот (АК) является важной задачей многих отраслей науки: медицины, биохимии, микробиологии, пищевой промышленности, фармакологии и сельского хозяйства. В настоящее время наиболее эффективно при массовых анализах может быть использована тонкослойная хроматография [12] (ТСХ). Денситометрия применяется для количественной тонкослойной хроматографии в качестве альтернативы методу высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), требующей дорогостоящего оборудования и расходных материалов. Применяют методы разделения свободных аминокислот и их производных с использованием одномерного и двухмерного вариантов тонкослойной хроматографии с последующей денситометрической обработкой хроматограмм. Программа "Dens" позволяет обрабатывать хроматограммы, полученные в двух вариантах с относительной погрешностью не более 3%. Двухмерная ТСХ дает возможность разделить большое количество соединений (до 22 наиболее важных аминокислот, в том числе и таурин) на коротком расстоянии проявления (стандартная пластина размером 10х10 см). Одномерная ТСХ позволяет анализировать до десяти и более образцов аминокислот одновременно. В работе [12] показана возможность разделения смеси 22-х свободных аминокислот методом двухмерной ТСХ (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Вид хроматограммы при ТСХ - разделении аминокислот с использованием нингидрина как проявителя.

В последнее время широко используются AAA-Direct [17] системы для анализа аминокислот. Для такого анализа, характерна комбинация анионо-обменной хроматографии и амперометрического определения.

Достоинствами этого метода являются:

Пределы определения от минимального до среднего диапазона (в пикомолях), без дериваций.

Приблизительно в 50 раз более чувствительный, чем анализ на основе нингидрина, и конкурентоспособный с методом предколоночной деривации.

Определяет аминокислоты, фосфоаминокислоты, углеводы, аминосахариды - за один отбор.

Быстрый количественный анализ аминокислот, таких как триптофан и серосодержащие аминокислоты.

BioLC® AAA-Direct конфигурация анализа аминокислот - усовершенствованное определение аминокислот. В отличие от других существующих методик, аминокислоты определяются непосредственно. С высокочувствительной, встроенной функцией импульсного амперометрического определения нет необходимости в предварительной или постколоночной деривации. Такая функция предлагает прямое определение первичных и вторичных аминокислот, аминосахаридов, фосфоаминокислот и основных продуктов окисления серосодержащих аминокислот (напр. цистеиновая кислота) в фемтомолях - пикомолях пределах диапазона определения с чувствительностью в 50 раз выше, чем в методике, основанной на нингидрине.

1.2.3 Электрохимические методы определения аминонокислот

Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с электрохимическим детектором [6] позволяет определить аминокислоты на уровне пикомоль. По этому методу можно определить 15 аминокислот в сыворотке крови человека. Так как немодифицированные аминокислоты не обладают электрохимической активностью, для детектирования их переводят в производные. Разделение производных проводят в градиентном или изократическом режимах элюирования. Из реагентов для получения производных только о-фталевый альдегид (ОФА), нафталин-2,3-дикарбоксиальдегид и 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол образуют с аминокислотами производные, обладающие электрохимической активностью. В качестве серосодержащих компонентов о-фталевого реагента используют 2-меркаптоэтанол или сульфит натрия. Общая продолжительность разделения 80 мин. Пределы обнаружения 0,5-5 пмоль. Методика применена для определения глутаминовой кислоты, аспарагина, серина, глутамина, гистидина, таурина, аланина, аргинина, метионина, изолейцина, орнитина, лейцина, фенилаланина, лизина и триптофана в сыворотке крови человека.

Для анализа нейромедиаторных аминокислот в реальных объектах используют обращено-фазовую ВЭЖХ с флуоресцентным или электрохимическим детектированием [7]. И поскольку, аминокислоты - нелетучие, неокрашенные соединения, слабо поглощающие в ультрафиолетовой области спектра, для их обнаружения также используется перевод в производные, обладающие флуоресцентной и электрохимической активностью. Наиболее широко применяется способ пред- и постколоночной дериватизации аминокислот, содержащих первичную аминогруппу, является образование изоиндолов при реакции с о-фталевым альдегидом и тиолами. Используя данную методику, можно в режиме изократического элюирования количественно определить глутаминовую кислоту, аспарагин, серин, глутамин, гистидин, таурин, аланин, аргинин и гаммааминомасляную кислоту в спинномозговой жидкости за 55 мин. Предел обнаружения 0,5-10 пмоль.

Реакцию о-фталевого альдегида с аминосодержащими соединениями в присутствии нуклеофильных агентов широко используют для чувствительного электрохимического, спектрометрического и флуориметрическое определения аминокислот [8]. В результате этой реакции образуются интенсивно флуоресцирующие продукты. С аминокислотами реакция идет по схеме:

где R-остаток аминокислоты, НХ-нуклеофильный агент, соединение Й-замещенный изоиндол. В качестве нуклеофильных агентов могут выступать алкилмеркаптаны, меркаптопроизводные спиртов и органических кислот, а также сульфит- и цианид-ионы. Аналитические характеристики метода не уступают методу с использованием 2-меркаптоэтанола, а устойчивость аналитической формы - замещенных изоиндолов - существенно выше.

Разработан экспресс-метод идентификации и определения 11 аминокислот в их смеси с использованием прибора капиллярного электрофореза без их предварительной дериватизации и модифицирующих добавок к буферному раствору [9]. Содержание компонентов определяют с помощью фотометрического детектора. Этот метод в отличие от метода ВЭЖХ обладает рядом преимуществ: высокой эффективностью разделения, малым расходом реактивов, экспрессностью анализа и простотой аппаратурного оформления. Разделения смеси аминокислот в капилляре добиваются использованием различного рода добавок к фоновому электролиту. В частности, применяют метанол, ацетон, смесь раствора тетрабората натрия и изопропанола. Время анализа составляет ~15 мин. Диапазон определяемых концентраций 1-1000 мг/л. По методике можно определить глутаминовую кислоту, глутамин, аргинин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, триптофан и др.

В последнее время широкое распространение в вольтамперометрии органических соединений получили химически модифицированные электроды (ХМЭ). Отличительной особенностью этих электродов является высокая селективность, которая достигается в результате взаимодействия модификатор-анализируемый компонент. Так, для вольтамперометрического определения цистеина используют угольно-пастовый электрод (УПЭ), модифицированный циклогексилбутиратом кобальта (II), меди (II), эфиром дибензо-18-краун-6 и его производными. Накопление аминокислоты на поверхности этих электродов происходит в виде соответствующего комплекса. Электрод, модифицированный оксидом рутения (IV), можно использовать для определения цистеина и цистина [14]. Способ инверсионно-вольтамперометрического определения позволяет анализировать такие серосодержащие аминокислоты, как цистеин, гомоцистеин и глутатион на УПЭ, модифицированных краун-эфирами дибензо-18-краун-6 или дибромдибензо-18-краун-6 [13]. Диапазон определяемых концентраций (2-5)·10-8 моль/л. В условиях проточно-инжекционного анализа разработана методика электрокаталитического определения серосодержащих аминокислот на графитовом электроде, модифицированном неорганической пленкой из гексацианоферрата (II) рутения (III) [15]. В качестве графитового материала используют стеклоуглерод или угольную пасту.

1.2.4 Фотометрические методы

Фотометрические методы основаны на измерении поглощения веществом светового излучения. В фотометрии применимы химические реакции, в результате которых получаются окрашенные продукты постоянного состава с высокой интенсивностью окраски. Фотометрические реакции органических соединений основаны на введении или создании в молекуле органического соединения системы сопряженных связей и образовании комплексных соединений. В фотометрических определениях аминокислот в качестве реагентов используют ароматические альдегиды (с образованием оснований Шиффа); ароматические амины (продукт - азосоединение); 1,2-нафтохинон-4-сульфокислоту (продукт - индонафтол); нингидрин (продукт - фиолетовый Руэмана) [18].

Определение тауфона в воздухе с 1,2-нафтохинон-4-сульфокислотой

Измерение концентрации таурина (в работе [21] - тауфона) в воздухе рабочей зоны используется как метод контроля на промышленных предприятиях. Метод основан на реакции взаимодействия тауфона с 1,2-нафтохинон-4-сульфокислотой в щелочной среде и последующем фотометрическом измерении окрашенного в желтый цвет продукта реакции при длине волны 440 нм. Отбор проб проводят концентрированием на фильтр. Нижний предел измерения содержания тауфона в анализируемом объеме раствора - 25 мкг. Нижний предел измерения концентрации тауфона в воздухе (при отборе 10 л воздуха) - 2,5 мг/м 3. Диапазон измеряемых концентраций в воздухе от 2,5 до 25 мг/м 3. Метод избирателен на стадии сушки и фасовки продукта. Определению тауфона мешают амины. Суммарная погрешность измерения не превышает ±15%. Время выполнения измерения, включая отбор проб - 40 мин.

Степень десорбции тауфона составляет 98,5%. Количественное определение содержания тауфона (мкг) в анализируемой пробе проводят по предварительно построенному градуировочному графику.

Определения, основанные на реакции с нингидрином

Растворы аминокислот, полипептидов, пептонов и первичных аминов при нагревании с нингидрином (1,2,3-индантрион) (НГ) приобретают синюю или фиолетовую окраску. Реакции между НГ и указанными соединениями протекают сложно (вещества претерпевают глубокое превращение). Предполагают, что сначала НГ восстанавливается, а аминокислоты окисляются, что сопровождается их декарбоксилированием и дезаминированием.

При дальнейшем взаимодействии избытка НГ с восстановленным НГ и аммиаком образуется окрашенный продукт конденсации.

Образующееся соединение имеет фиолетово-синюю окраску (л max=570 нм). Нингидриновая реакция неспецифична, так как окрашенный продукт с нингидрином дают также NH3 и другие соединения, содержащие аминогруппу (в том числе белки и пептиды). Однако реакции с этими соединениями осуществляются без выделения СО2 (нингидриновая реакция с выделением СО2 специфична только для б-аминокислот). Реакцию используют для колориметрического количественного определения б-аминокислот, в том числе в автоматических аминокислотных анализаторах [18].

Конечным продуктом является фиолетовый (пурпурный) Руэмана. Казалось бы, что во всех случаях окраска раствора должна быть одинаковой. Однако возможны и другие процессы, как, например, взаимодействие образовавшихся альдегидов (побочные продукты) с аминокислотами, приводящие к появлению по-разному окрашенных продуктов [18].

В работе [19] предлагается другой механизм нингидриновой реакции:

Выход продукта реакции зависит от свойств определяемой аминокислоты. Наиболее интенсивные окраски при прочих равных условиях наблюдаются при определении глицина, изолейцина, лейцина, норлейцина; несколько менее интенсивная окраска - при реакции с серином, фенилаланином, цистеином. Величины 510 [18] продуктов реакции лежат в пределах 1,8·104-3,3·104. Окрашенные продукты реакции нестабильны, и интенсивность окраски раствора довольно быстро уменьшается. Для стабилизации в состав реактива вводят хлорид кадмия, который с фиолетовым Руэмана образует устойчивые комплексные соединения. Присутствие кадмия влияет также на скорость реакции и на спектральную характеристику продукта. Хлорид кадмия можно заменить разбавленным раствором сульфата меди, который с фиолетовым Руэмана образует оранжево-красное соединение с max=530 нм.

Таким образом, значения молярного коэффициента поглощения продуктов реакции с нингидрином зависят от условий и в расчете на определяемое вещество, в зависимости от выхода реакции, составляют п·103 - 20·103.

В целом, для нингидриновой реакции характерна высокая чувствительность, поскольку отдельные ее стадии отличаются хорошими выходами и воспроизводимостью.

В работе [18] приведен также ряд методических рекомендаций для определения б-аминокислот, в том числе и таурина:

I. Смешивают 1 мл раствора, содержащего 0,02--0,4 мг б -аминокислоты, с 0,5 мл буферного раствора (рН 5,3--5,4) и 0,5 мл 3%-ного раствора нингидрина в метилцеллозольве. Нагревают 15 мин при 100°С, после чего добавляют 5мл 50%-ного изопропилового спирта и взбалтывают. После охлаждения до комнатной температуры красный раствор фотометрируют при 570 нм. Таким способом определяют аланин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, валин, глицин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин, изолейцин, лизин, орнитин, метионин, серии, таурин, треонин, тирозин, фенилаланин, этаноламин, а также аммиак. При определении пролина и оксипролина получают желтый раствор, который фотометрируют при 440 нм. Для приготовления буферного раствора растворяют 270 г ацетата натрия в 200 мл воды, добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и воду до 750 мл. К 500 мл этого раствора добавляют 10 мл 0,01 М раствора NaCN.

II. Раствор в 80%-ном этиловом спирте, содержащий около 5 мкг аминокислоты, смешивают с 2 мл 0,2%-ного раствора нингидрина в изобутиловом спирте и этим же спиртом разбавляют до объема 10 мл. Нагревают 3 мин при 80єС, затем охлаждают до 22єС и фотометрируют при длинах волн от 530 до 560 нм. Так определяют аланин, аспарагин, валин, глицин, изолейцин, лизин, фенилаланин и ряд других аминокислот.

III. К 1 мл анализируемого раствора прибавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл реактива, нагревают 1 ч при 100°С. После охлаждения разбавляют ледяной уксусной кислотой до объема 5 мл и через 1 ч красные растворы фотометрируют: в случае определения лизина при 500 нм; оксилизина - 450 нм; орнитина и пролина - 515 нм; цистеина - 570 нм. Для приготовления реактива при 70°С растворяют 0,25 г нингидрина в смеси 4 мл Н3РО4 (1 : 1) и 6 мл ледяной уксусной кислоты.

IV. Для анализа аминокислот в природных водах сначала проводят концентрирование. Пропускают 1 л исследуемой воды со скоростью 10--12 капель/мин через колонку (1 x 20 см) с катионитом КУ-2 в Н+-форме. Затем аминокислоты десорбируют с колонки 80 мл 2 н раствора NaOH. Полученный раствор выпаривают досуха при 100°С и остаток растворяют в 2 мл воды. Этот концентрат смешивают с 1 мл реактива, добавляют 2 капли насыщенного водного раствора CdCl2 и 5 мл н-бутилового спирта. Нагревают 15 мин при 100°С и после охлаждения добавляют 1 мл 25%-ного раствора сегнетовой соли. Слой бутилового спирта отделяют, разбавляют этим же спиртом до объема 6 мл и фотометрируют при 505 нм. Калибровочный график строят, используя стандартные растворы: аминоуксусной кислоты в (2--30 мкг в пробе в пересчете на азот). Отмечается, что интенсивность и устойчивость окраски в среде бутилового спирта выше, чем в воде. Реактив готовят растворением 75 мг СdCl2, 6 мл воды, 0,3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 г нингидрина в 100 мл ацетона.

Для некоторых аминопроизводных (пролина, эфедрина) приводятся условия экстракционно-фотометрических определений [18].

Нингидриновая реакция использована в работе [20] для определения капролактама (КЛ) при концентрациях от 0,1 до 20,0 мг/л в сточных водах предприятий по его производству и переработке. В работе указано, что спектрофотометрический метод определения КЛ с нингидрином, несмотря на высокое значение эффективного молярного коэффициента светопоглощения = 10600, имеет низкую чувствительность -- 50 мг/л, что обусловлено пятидесятикратным разбавлением пробы в ходе анализа. При реакции с аминокислотой нингидрин восстанавливается до гидриндантина, а затем конденсируется с аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя краситель типа мурексида -- дикетогидриндилидендикетогидриндамин (ДИДА). Аммиак образуется в результате окислительного расщепления аминокислот нингидрином. Реакция протекает только в присутствии вещества, способного восстановить нингидрин до гидриндантина. Поэтому предлагается в реагентную смесь кроме нингидрина вводить гидриндантин. Авторы отмечают, что вместо метилцеллозольва лучше использовать менее токсичный этилцеллозольв. Этилцеллозольв позволяет удержать продукты реакции в растворе без разбавления и повышает интенсивность окраски так, что значение (М-1·см-1) увеличивается с 10600 до 19600, приближаясь к ДИДА (21600). Область максимального светопоглощения окрашенными растворами находится в интервале длин волн от 560 до 585 нм. Так, оптическая плотность при 570 нм выше оптических плотностей при указанных длинах волн всего на 0,6%.

Предлагается [20] следующий раствор реагентов, свежеприготовленный: растворяют 2 г нингидрина и 0,3 г гидриндантина в 75 мл этилцеллозольва и добавляют 25 мл буферного раствора с pH = 6,5.

Для проведения нингидриновой реакции пипеткой отбирают 15 мл подготовленной для анализа сточной воды в пробирку, 8 мл раствора реагентов. Пробирку закрывают пробкой, перемешивают и на 22 мин помещают в баню с кипящей водой. Охлаждают до комнатной температуры водопроводной водой, и после выравнивания температур растворов в пробирках измеряют оптическую плотность по отношению к дистиллированной воде, в том числе и холостой опыт. Для приготовления буферного раствора с рН=6,5 в дистиллированной воде растворяют 544 г уксуснокислого натрия (гидрат) и 4 мл ледяной уксусной кислоты (плотность 1049 кг/м3) и доводят объем до 1 л. Для получения градуировочной зависимости готовят стандартные водные растворы КЛ с концентрацией 0,1; 0,5;...; 20,0 мг/л.

Из приведенных методик можно выделить факторы, которые необходимо учитывать и проверять при постановке (апробации) методики определения таурина:

в качестве органического растворителя лучше использовать этилцеллозольв, который повышает интенсивность окраски раствора и менее токсичен, чем метилцеллозольв;

уточнение рН буферного раствора, поскольку в литературных источниках приводятся границы 5,3 - 6,5;

уточнение температуры реакции и режима нагрева;

проверка необходимости введения гидриндантина в смесь реагентов;

проверка встречающихся указаний на стабилизирующее действие спирта в составе реактива.

1.3 Мягкие контактные линзы

Контактные (т.е. надевание непосредственно на глазное яблоко под веки) линзы получили в последнее время большое распространение для улучшения зрения при близорукости, дальнозоркости, астигматизме, старческой дальнозоркости, а также для усиления или изменения цвета глаз. В разных странах ими пользуется от 2 до 10% населения. Первые контактные линзы созданы в начале 20-го века и были изготовлены из стекла, далее появились жесткие контактные линзы из полиметилметакрилата, в 60-е годы разработаны первые мягкие линзы из НЕМА, в 90-е - кислородопроницаемые жесткие линзы.

1.3.1 Основные характеристики мягких контактных линз

Мягкие контактные линзы (МКЛ) (рис. 1.2) [22] изготавливают из гидро-фильных полимеров, которые легко поглощают воду до определенной максимальной концентрации, уровень которой определяется такими физическими параметрами как температура, давление, рН и др.

Рис. 1.2. Мягкие контактные линзы и материалы для их изготовления.

Гидрогелем называется состояние полимерного каркаса с включенной в него водой.

Рис. 2.3. Две цепочки гидроксиэтилметакрилата

Полимерный каркас может содержать различные гидрофильные группы и поперечные сшивки, которые и определяют равновесное состояние наполненного водой гидрогеля. Гидрофильными группами могут быть гидроксильные, амидные, лактамные и карбоксильные группы. Обычно используемым для сшивок агентом является этиленгликоль-диметакрилат (EGDMA). Без сшивок большинство гидрофильных полимеров растворилось бы в воде. Способность гидрогеля всасывать воду приводит к образованию водных каналов для передачи кислорода. Первые гидрогельные линзы были изготовлены чешским ученым Отто Вихтерле из гидрогеля рНЕМА (поли-2-гидроксиэтилметакрилат (рис. 2.3)); они оказались слишком толстыми и пропускали кислорода лишь ненамного больше, чем жесткие газонепроницаемые линзы из РММА (полиметилметакрилата). Революция в мире контактных линз произошла, когда стало возможным изготовление тонких линз с большой кислородопроницаемостью. Появление этих линз стимулировало поиски новых гидрогельных материалов, которые стали бы еще более физиологически совершенными.

Строение гидрогелей

Гидрогели представляют собой поперечно сшитые пористые, хорошо набухающие, но не растворяющиеся в воде полимеры. Обычно их получают полимеризацией водорастворимых ненасыщенных соединений в присутствии бифункционального сшивающего агента. В своем исходном состоянии до гидратации они похожи на жесткие полимеры - негибкие, ломкие и жесткие. При погружении в воду гидроксильные группы сухого полимера притягивают молекулы воды, и полимер поглощает воду. Объем поглощенной воды зависит от количества гидроксильных компонентов в его структуре. При насыщении водой полимер становится мягким и гибким.

Гидрогели имеют аморфное строение. Структура гидрогеля пронизана многочисленными порами, размеры и число которых у разных материалов сильно отличаются. Однако размеры пор (0,5-3,5 мкм) слишком малы для проникновения микроорганизмов, если структура полимера не повреждена. В то же время, многие ионы, консервирующие вещества и растворимые в воде препараты типа стероидов и антибиотиков могут с легкостью диффундировать как в гидрогель, так и в обратном направлении.

Основные характеристики МКЛ

Содержание воды в контактной линзе является одним из главных параметров МКЛ. Высокое содержание воды обеспечивает комфортность ношения линзы и снабжение роговицы кислородом. Вода обеспечивает продвижение кислорода через материал гидрогелевой линзы. Молекулы кислорода растворяются в воде и перемещаются через материал линзы к роговице.

Кислородная проницаемость критична для мягких контактных линз, так как «слезный насос» недостаточно эффективен для обеспечения роговицы кислородом. Большая часть необходимого роговице кислорода поступает сквозь линзу. Для характеристики кислородной проницаемости материала (но не конкретной линзы определенной толщины) используется коэффициент кислородной проницаемости (Dk). (Здесь D - коэффициент диффузии, k - коэффициент растворимости; в практике врача эти параметры по отдельности практически не встречаются).

Кислородная проницаемость материала прямо пропорциональна содержанию в нем воды и не зависит от толщины материала. Для характеристики способности конкретной линзы пропускать кислород используется коэффициент пропускания кислорода - Dk/L, где L - толщина линзы (обычно берется толщина линзы в центре). Этот коэффициент уже является характеристикой конкретной линзы и зависит, в частности, от ее толщины. Например, контактные линзы для коррекции сильно выраженной миопии, будучи очень тонкими в центральной зоне, позволяют кислороду легко проникать через них (Dk/L будет большим). С другой стороны, линзы для коррекции афакии очень толстые в центре и плохо пропускают кислород (Dk/L будет низким).

При снижении содержания воды происходит соответствующее снижение Dk/L. При этом могут изменяться и другие параметры линзы, что может повлиять на посадку линз. Снижение содержания воды на 20% приводит к снижению кислородной проницаемости приблизительно в 2 раза.

У большинства современных МКЛ кислородопроницаемость определяется в большей степени уровнем гидратации, чем природой полимерной структуры. Главным недостатком высокогидрофильных линз является их высокая чувствительность к механическим повреждениям, по сравнению с линзами со средним содержанием воды. Высокогидрофильные линзы, если сделать их слишком тонкими, могут даже вызывать повреждение эпителия роговицы, из-за его обезвоживания in situ.

Для изготовления более качественных МКЛ ведутся постоянные поиски новых материалов с более высоким содержанием воды, повышенной кислородной проницаемостью, увеличенной прочностью.

1.3.2 Применение МКЛ

Контактные линзы в течение длительного времени служили, главным образом, средством оптической коррекции зрения. Линзы стали использоваться в лечении некоторых заболеваний глаза в качестве искусственной повязки для роговицы и средства введения лекарственных веществ в глаз. Однако если применение МКЛ с бандажной целью уже вошло в практику офтальмологов, то вопросы, связанные с введением лекарственных веществ в глаз с помощью линз, находится в стадии разработки. Известно, что МКЛ, пропитанные лекарственными веществами, продлевают их лечебное действие и вследствие этого являются более эффективным методом введения препаратов в орган зрения по сравнению с инстилляционным [23].

Для изготовления МКЛ применяются полимерные материалы на основе гидрогелей. Благодаря свойствам гидрогелей, обеспечивающим диффузию электролитов, кислорода и углекислого газа, мягкие линзы в меньшей степени, чем жесткие, влияют на метаболизм роговицы. Э ...........