Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз - автореферат

Для вивчення звязування використано АКТГ, мічений за Tyr23, а Tyr2, який бере участь у формуванні центру, відповідального за гормон-рецепторну взаємодію, залишається нейодованим. Такий ліганд повністю зберігає біологічну активність, зокрема, здатність взаємодіяти з рецепторами та активувати стероїдогенез.

Параметри звязування ¹²⁵І-ПРЛ в мікросомній фракції кори надниркових залоз людини свідчать про наявність тільки одного типу сайту звязування ПРЛ, який за своїми характеристиками є типовим представником рецепторів високої афінності та низької ємності: B_max=1,2±0,08 х 10^-10 М; K_a=0,14±0,02 х 10⁹ М^-1. Оцінка параметрів звязування ¹²⁵І-ПРЛ ізольованими адренокортикальними клітинами свідчить, що афінність рецепторів у цьому випадку є подібною до мембран мікросом. Цей факт може бути додатковим свідченням того, що диспергування і очищення адренокортикоцитів істотно не впливає на нативність клітин та їх здатність до відтворення нормальних фізіологічних процесів. Більш низьку абсолютну звязувальну ємність плазматичних мембран адренокортикоцитів порівняно до мембран мікросом можна пояснити тим, що на поверхні клітини є доступною лише незначна частка тих рецепторів, які містять мікросоми. Специфічне звязування (B_sp) як ¹²⁵І-АКТГ, так і ¹²⁵І-ПРЛ знижується у мікросомах кори надниркових залоз людини за присутності хлодитану (рис. 5).

Звязування починає зменшуватись, починаючи з концентрації 0,01 мкмоль/л, та сягає мінімуму за присутності 0,3 мкмоль/л хлодитану (рецепція ¹²⁵І-ПРЛ) або 1,0 мкмоль/л хлодитану (рецепція ¹²⁵І-АКТГ). Подальше збільшення концентрації хлодитану нівелювало його інгібувальний ефект на звязування досліджуваних лігандів (рис. 5). Факт встановлення залежності зниження специфічного звязування ¹²⁵І-АКТГ та ¹²⁵І-ПРЛ від концентрації хлодитану у мікросомній фракції адренокортикоцитів може стати підставою для пошуків способів подолання резистентності деяких типів пухлин до цього препарату та збільшення ефективності його використання.

Шляхи внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів естрадіолу в корі надниркових залоз

Продукція cAMP та cGMP, активність ПКА та ПКС в корі надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Дослідження молекулярних механізмів дії естрогенів призвело до появи нових теорій, більш чітко окреслило етапи реалізації ефектів стероїдних гормонів. До останнього часу вплив естрогенів на клітини-мішені повязували виключно з геномними ефектами, що не потребують залучення вторинних посередників для внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів. Зараз розглядається участь в цих процесах декількох месенджерних систем, серед яких важливе місце відводять cAMP-залежному каскаду.

При визначенні вмісту сумарних 11-ОКС у середовищі інкубації ми показали дозозалежне збільшення продукції стероїдів зрізами кори надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Максимальний рівень синтезу кортикостероїдних гормонів спостерігається через 4 год інкубації при концентрації естрадіолу 100 мкМ і становить 6212 841 нмоль/л у порівнянні з 2363 271 нмоль/л у контрольних пробах (р < 0,01; n=10; критерій Фішера). Наші дослідження показали, що культивування адренокортикальних клітин новонарождених поросят в середовищі з 17-естрадіолом також призводить до суттєвого збільшення продукції 11-ОКС.

Утворення cAMP тканиною кори надниркових залоз людини вірогідно збільшується через 3 год інкубації.

Ці зміни стають ще істотнішими через 4 год інкубації, коли спостерігається 7-разове збільшення продукції cAMP. Рівень cGMP не змінювався ні за умов використання різних концентрацій естрадіолу, ні за умов різних термінів інкубації.

Дослідження впливу естрадіолу на активність ПКА та ПКС в субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини дозволило продемонструвати, що інкубація з естрадіолом-17в протягом 4 год у концентрації 10 мкМ не призводить до активації ПКА ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях (табл. 3). При збільшенні концентрації до 100 мкМ протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає більш ніж на 50 % порівняно з контролем. Визначення активності ПКС в мікросомній фракції показало, що естрадіол активує цю кіназу. Активність ПКС збільшується на 50 % у мікросомній фракції зрізів кори надниркових залоз за умов дії естрадіолу (100 мкМ) (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив 17-естрадіолу in vitro на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини

Примітка. * - різниця з контролем є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента; n = 5.

Продемонстровані шляхи пострецепторної передачі регуляторних сигналів естрадіолу за умовах in vitro на первинній культурі клітин надниркових залоз поросят і зрізах кори надниркових залоз людини залишають відкритим питання щодо тотожності цих шляхів на рівні цілісного організму. Відомо, що природні та синтетичні естрогени активно використовуються для лікування раку простати у чоловіків [Tammela, 2004], тому дослідження ефектів естрадіолу на інтактних та кастрованих експериментальних тваринах можуть дозволити певну екстраполяцію на зміни функції надниркових залоз у людини.

Після 3 днів введення естрадіолу спостерігалось істотне зростання рівня сумарних 11-ОКС у плазмі крові як інтактних, так і орхіектомованих щурів (табл. 4). Показано, що введення 50 мкг естрадіолу інтактним тваринам призводить до збільшення рівня кортикостероїдів у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами, що отримували інєкції олії. При введенні 100 мкг естрадіолу цей показник зростає більш ніж у 2 рази. Подібний ефект естрадіолу спостерігався і у кастрованих тварин. У контрольних орхіектомованих щурів рівень 11-ОКС був нижчим, ніж у інтактних (яким вводили сливову олію). Збільшення концентрації кортикостероїдних гормонів під впливом естрадіолу було подібним в обох експериментальних групах. Виходячи з цих даних можна стверджувати, що рівень тестостерону в організмі не має помітного впливу на зміни функції адренокортикальних клітин під впливом естрадіолу. Ні орхіектомія, ні замісне введення тестостерону щурам не призводили до змін концентрації вільного холестерину або його ефірів, які є попередниками синтезу кортикостероїдів [Duda et al., 1985].

Таблиця 4

Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на вміст сумарних 11-гідроксикортикостероїдів у плазмі крові самців щурів (нмоль/л)

Примітки:

*, ** - різниця з контролем є вірогідною, відповідно р < 0,05 і р < 0,01;

+ - різниця між інтактними і орхіектомованими тваринами є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента.

Оскільки найважливішими етапами переносу сигналу основного регулятора функції кори надниркових залоз - АКТГ є активація аденілатциклази та cAMP-залежної протеїнкінази А, ми досліджували вплив естрадіолу in vivo на активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз. Відомо, що ПКА відіграє суттєву роль у найважливіших етапах стероїдогенезу: відщепленні бокового ланцюга холестерину цитохромом Р450_scc, активації білка StAR, транспорті вільного холестерину до внутрішнього шару мембрани мітохондрій [Gallo-Payet et al., 2003; Richards, 2001]. Визначення активності ПКА в субклітинних фракціях показало, що триденне введення естрадіолу призводить до істотного зростання активності ПКА як у цитозольній, так і у мікросомній фракціях кори надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів (табл. 5). Вірогідність змін була вищою у мікросомній фракції. Ми визначали також активність ПКС, яка може брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів (табл. 5). Активність ПКС вірогідно збільшується як в цитозольній фракції адренокортикоцитів, так і, ще в більшому ступені, в мікросомній фракції надниркових залоз інтактних і орхіектомованих щурів, що отримували естрадіол.

Таблиця 5

Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на активність протеїнкіназ А та С у субклітинних фракціях кори надниркових залоз самців щурів (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка)

Примітки:

*, ** - різниця з контролем є вірогідною, відповідно р < 0,05 і р < 0,01; критерій Фішера; + - різниця між інтактними і орхіектомованими тваринами є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента.

Естрадіол підвищує активність ПКС в мікросомній фракції кори надниркових залоз у 1,7 рази в групі інтактних тварин та у 2,0 рази в групі орхіектомованих тварин. Зміни рівня кортикостероїдів і активності ПКА та ПКС під впливом естрадіолу бензоату є подібними у інтактних та кастрованих самців щурів, що дозволяє зробити висновок: видалення сімяників не впливає на відповідь надниркових залоз на естрогени. Таким чином, отримані дані дозволяють вважати, що збільшення синтезу кортикостероїдів та активація ПКА і ПКС у субклітинних фракціях адренокортикоцитів інтактних та орхіектомованих щурів внаслідок дії естрадіолу свідчить про причетність естрогенів до регуляції функції кори надниркових залоз і про залучення протеїнкіназ до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикальних клітинах.

Отже, естрадіол in vitro та in vivo посилює продукцію кортикостероїдних гормонів в корі надниркових залоз і збільшує рівень cAMP, який, в свою чергу, є активатором cAMP-залежної ПКА. У субклітинних фракціях клітин збільшується активність ПКА і ПКС, що свідчить про участь цих ферментів в реалізації ефектів естрогенів в корі надниркових залоз. Узагальнюючи наші результати і дані інших дослідників [Aronica et al., 1994; Seval et al., 2006] можна висловити припущення, що регуляція стероїдогенезу естрогенами в корі надниркових залоз зумовлена здебільшого cAMP-залежною системою. Ймовірною є також участь систем, до яких залучена ПКС. Отримані дані дозволяють розширити розуміння сукупності негеномних механізмів, за якими естрогени здатні чинити контроль метаболічних процесів в адренокортикальній тканині.

Участь сигнального каскаду, повязаного з протеїнкіназами, що активуються мітогенами, в опосередкуванні сигналу естрадіолу. В опосередкуванні впливу естрогенів на клітини-мішені зараз розглядається участь декількох сигнальних систем, серед яких важливе місце відводять крім протеїнкіназ А і С, месенджерним системам, що використовують як вторинні посередники протеїнкінази, що активуються мітогенами. Каскад MAPK/ERK є одним з провідних шляхів сигнальної трансдукції естрогенів, що залучається до реалізації широкого спектру ефектів, спрямованих на проліферацію клітин-мішеней. Показано, що активована естрогенами форма ERK1/2 здатна до транслокації в ядро і прямої взаємодії з ядерними транскрипційними факторами [Edwards, 2005; Lee, McEwen, 2001].

В корі надниркових залоз щурів естрадіол бензоат чинить найбільш виразний вплив на рівень ERK1/2 кінази (рис. 7). За результатом Вестерн-блот аналізу, введення 50 мкг естрадіолу не призводить до змін вмісту ERK1/2 в адренокортикальній тканині порівняно із контрольними тваринами, що отримували інєкції олії. Після тридобового введення естрадіолу в дозі 100 мкг цей показник вірогідно зростає в 1,7 рази (рис. 7). Збільшення вмісту JNK кінази спостерігається в адренокортикальній тканині при введенні 100 мкг естрадіолу бензоату. Рівень р38 МАР-кінази при введенні естрадіолу в обох дозах залишається без змін.

В інших типах клітин, зокрема раку молочної залози MCF-7, фосфорилювання р38 кінази і, особливо, ERK1/2 збільшується під впливом 17в-естрадіолу в клітинах [Gutzman et al., 2005].

Потрібно зазначити, що стимульована естрогенами транскрипція полягає в активації експресії низки генів, серед яких протоонкогени c-jun та c-fos [Albanito et al., 2007]. Продукти активації цих генів, білки с-jun і c-fos, утворюючи гомодимерні та гетеродимерні комплекси, входять до складу фактора транскрипції АР-1, який є надзвичайно важливим елементом трансдукції сигналу в ядрі. Ми визначали в адренокортикоцитах щурів рівень білкових факторів транскрипції с-jun та c-fos, які можуть брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів в корі надниркових залоз (рис. 7). Максимальний рівень с-fos спостерігається при введенні 100 мкг естрадіолу. В цих умовах рівень білка с-jun в корі надниркових залоз практично не змінюється.

Встановлено, що c-jun та c-fos не єдині ранні протоонкогени|, експресія яких стимулюється естрогенами. 17в-естрадіол також істотно|суттєво| збільшує рівень експресії мРНК|посилює| протоонкогена| c-myc в ембріональних стовбурових клітинах [Han et al., 2006].

Таким чином, можна зробити висновок, що до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в клітинах кори надниркових залоз можуть бути залучені МАРК ERK1/2 та фактор транскрипції c-fos, який активується цією кіназою.

Рис. 7. Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на вміст ERK1/2 та c-fos у корі надниркових залоз щурів.

Репрезентативні результати імуноблот-аналізу одного з 3-х дослідів (А) та усереднені дані (Б). 1 - контроль, 2 - Е2 50 мкг/тварину, 3 - Е2 100 мкг/тварину. Різниця з контролем є вірогідною, * - p < 0,05; непараметричний U-критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні, критерій Стьюдента.

Дослідження впливу NAE на стероїдогенез в корі надниркових залоз. участь систем вторинних посередників перенесення регуляторних сигналів nae в адренокортикоцитах

Зміна біосинтезу кортикостероїдів під впливом NAE та дофаміну. N-ацилетаноламіни завдяки ліпотропним властивостям добре поглинаються збагаченими на ліпіди тканинами, зокрема адренокортикальною. Розподіл введеного щурам міченого N-пальмітоїлетаноламіну свідчить про переважне його включення саме до надниркових залоз [Жуков та ін., 2000]. Оскільки стероїдогенез є основною функцією цієї залози, NAE можуть відігравати важливу роль в синтезі кортикостероїдних гормонів. Відповідь кори надниркових залоз на введення NAE в організм може бути повязана із зміною функції гіпофізу і вищих регуляторних центрів. Тому дослідження кортикостероїдогенезу було проведено на зрізах надниркових залоз в середовищі, що містило NAE, а також дофамін. Дофамін, який є інгібітором секреції альдостерону, є одним з найменш досліджених модуляторів адренокортикальної функції. Як нейромедіатор, дофамін відіграє важливу роль в регуляції секреції пролактину, який, в свою чергу, виконує регуляторну функцію в клітинах кори надниркових залоз.

В дослідах використовували N-стеароїлетаноламін або суміш N-ацилетаноламінів, в якій більше 60 % складають залишки ненасичених жирних кислот: 6,3 % арахідонової, 1,8 % лінолевої, 7,6 % гондової, 18,4 % олеїнової, 6,4 % пальмітоолеїнової, 16,7 % ейкозапентаенової, 2,7 % докозагексаенової; близько 30 % - ацили насичених жирних кислот: 6,4 % міристинової, 22,4 % пальмітинової, 3,0 % стеаринової, 1,0 % арахінової, 1,4 % бегенової.

Додавання до середовища інкубації N-стеароїлетаноламіну у концентраціях 10^-7 10^-6 М не викликало суттєвих змін щодо включення мітки в альдостерон та кортикостерон. Однак у присутності N-стеароїлетаноламіну в концентрації 10^-5 М мічення гормонів підвищувалось.

Вплив дофаміну на включення мітки холестерину в альдостерон і кортикостерон залежав від його концентрації (рис. 8). В концентрації 10^-7 - 10^-6 М дофамін не впливав на включення холестеринової мітки в кортикостерон. Мічення альдостерону мало тенденцію до зростання при концентрації дофаміну 10^-6 М. Вірогідним пригнічення мічення кортикостерону і альдостерону ставало при концентрації дофаміну 10^-5 М. Потрібно зазначити, що це гальмування відбувається лише при досить високій концентрації дофаміну.

Аналіз особливостей сумісної дії дофаміну та NAE проведено з використанням таких концентрацій сполук, котрі самі по собі не змінювали включення мітки в альдостерон і кортикостерон - 10^-6 М (рис. 9). Дофамін у використаній концентрації дещо збільшував включення мітки в альдостерон, але не в кортикостерон.

Встановлено, що кожен з препаратів NAE потенціював включення ³Н-холестерину в кортикостероїди за дії дофаміну. При цьому радіоактивність альдостерону та кортикостерону зростала в порівнянні з контролем на 60-80 %. Для альдостерону суттєве підвищення включення ³Н-холестерину досягалось тільки при додаванні суміші ненасичених NAE.

За контроль (100 %) слугували проби, що не містили NAE і дофаміну. Порівняння з контролем: * - р < 0,05, критерій Стьюдента, + - р < 0,05, непараметричний U-критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні; n=3.

Не існує чітких односпрямованих результатів, які б характеризували вплив NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз людини і експериментальних тварин. Проте не викликає сумнівів той факт, що NAE мають адреномодуляторні властивості. Ми показали, що N-ацильовані етаноламіни in vitro суттєво збільшували секрецію 11-ОКС в адренокортикальній тканині самок щурів, проте утворення 11-ОКС зрізами надниркових залоз людини та самців щурів в присутності NAE пригнічувалось (дані не наведені). Питання залежності відповіді на NAE від статі тварин обговорювати вкрай важко, тому що характер впливу статевих гомонів на синтез кортикостероїдів в корі надниркових залоз не досліджено ґрунтовно. Статеві відмінності щільності місць звязування каннабіноїдів та зміни їх рецепції під впливом статевих гормонів було знайдено в деяких структурах мозку, але фізіологічна роль цих відмінностей залишається незясованою [De Fonseca et al., 2005].

Слід відзначити, що вплив суміші NAE, яка містила похідні етаноламіну з насиченими і з ненасиченими залишками жирних кислот, на мічення альдостерону був виразнішим, ніж у випадку використання N-стеароїлетаноламіну (рис. 9). Очевидно, властивості залишків жирної кислоти, що входять у склад NAE, мають значення у визначенні реакції адренокортикоцитів. Це, в свою чергу, може свідчити про те, що дія NAE не обмежується впливом на мембрани, а й може впливати на месенджерні механізми або на стероїдогенез безпосередньо. Зростання включення мітки ³H-холестерину до кортикостероїдів під впливом NAE може пояснюватись збільшенням проникнення вільного міченого холестерину до зрізів.

Одним із можливих механізмів впливу NAE може бути зміна транспорту електронів від NADPH на цитохром Р450, який забезпечує реакції гідроксилювання стероїдів. У дослідах in vitro виявлено зниження синтезу 11-ОКС зрізами надниркових залоз самців щурів при додаванні NAE [Гула та ін., 2000]. Перенесення електронів на штучні акцептори, цитохром С та дихлорфеноліндофенол в цих же умовах не змінюється. Це дозволяє вважати, що процес перенесення електронів від NADPH на цитохром Р450 під впливом NAE не змінюється, а гальмування стероїдогенезу у присутності NAE може обумовлюватись зниженням активності аденілатциклази. Пригнічення аденілатциклазної активності і зниження рівня cAMP є найбільш вивченим механізмом переносу сигналів від канабіноїдних рецепторів СВ1 [Felder et al., 1995; Maccarrone et al., 2001]. Встановлено, що активація канабіноїдних рецепторів, сполучених з G_(i/0)-cубодиницею GTP-звязуючого білка, призводить до інгібування аденілатциклази і пригнічення ефектів, залежних від cAMP-залежної протеїнкінази А.

Роль циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А і С в реалізації ефектів N-ацилетаноламінів в адренокортикоцитах. Дослідження впливу етаноламінів, N-ацильованих сумішшю жирних кислот, на продукцію cAMP корою надниркових залоз людини дозволило показати, що помітне зниження вмісту cAMP в адренокортикальній тканині спостерігається вже при концентрації NAE 0,3 мкг/мл, при збільшенні концентрації NAE вміст cAMP продовжує зменшуватись і становить 0,083 ± 0,005 пмоль/мг тканини при концентрації NAE 33 мкг/мл. В контрольних пробах вміст cAMP становить 0,200 ± 0,012 пмоль/мг тканини. Рівень cGMP за цих умов залишається незмінним.

Для зясування можливості модуляції стероїдогенезу за рахунок змін активності ПКА і ПКС ми провели пряме визначення впливу NAE на активність ферментів в субклітинних фракціях. Суміш N-ацильованих похідних етаноламіну змінює активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини, як це видно з табл. 6.

Таблиця 6

Вплив NAE на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини

Примітка. * - вірогідно по відношенню до контролю, p < 0,05; критерій Стьдента; n=4.

У цитозольній фракції клітин спостерігається вірогідне зниження активності ферменту, починаючи з концентрації NAE 3,3 мкг/мл. При збільшенні концентрації NAE до 33 мкг/мл протеїнкіназна активність знижується на 34 % у порівнянні з контрольними пробами. У досліджених концентраціях NAE in vitro не впливає на активність ПКА у мембранній фракції адренокортикоцитів.

Внесення суміші NAE до середовища інкубації в жодній з досліджуваних концентрацій не впливає на активність ПКС в цитозольній фракції клітин кори надниркових залоз (табл. 6). У мембранній фракції зростання протеїнкіназної активності спостерігається тільки при одній концентрації NAE 3,3 мкг/мл.

Виходячи з отриманих даних, виявлені прямі стимулювальні ефекти N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз можуть пояснюватись залученням ПКС до перенесення регуляторних сигналів NAE в адренокортикоцитах. Привертає увагу той факт, що для суміші NAE концентрація 3,3 мкг/мл виявилася найбільш біологічно активною в дослідах in vitro як в корі надниркових залоз людини, так і самок щурів. Можливо, ПКС не є єдиною протеїнкіназою, що активується NAE в адренокортикоцитах. Для деяких типів клітин існують дані щодо активації анандамідом, 2-арахідоноїлгіцеролом та 9-тетрагідроканабінолом протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також кінази фокальних контактів [Lepicier et al., 2003].

Вплив NAE на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканинах надниркових залоз людини. Вважається, що при пошкодженні багатьох тканин і, в першу чергу, нервової тканини та серцевого мязу утворюються NAE, які виконують захисну функцію щодо пошкодженої тканини. Стабілізаційні ефекти NAE щодо травмованих тканин можуть бути повязані з їх протекторним впливом на клітинні мембрани. Нашу увагу NAE привернули такими ефектами, як здатність викликати і посилювати апоптоз та пригнічувати проліферацію у різних типах тканин [Гула та ін., 2006; Maccarrone et al., 2002], в тому числі і в пухлинній тканині надниркових залоз людини [Kostyuchenko et al., 2005]. Проте, незважаючи на проведені дослідження, антипроліферативний та проапоптичний ефекти NAE в різноманітних пухлинах кори надниркових залоз вивчені ще дуже недостатньо.

Тому метою наступного етапу досліджень було визначення залежності ступеня фрагментації ДНК в деяких пухлинних тканинах надниркових залоз людини від вмісту NAE (N-стеароїлетаноламіну та суміші ненасичених NAE) в інкубаційному середовищі (табл. 7). In vitro суміш NAE, що містила похідні етаноламіну здебільшого з ненасиченими залишками жирних кислот, не змінює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині у випадках альдостером та андростером. Водночас в умовно нормальній тканині у випадку феохромоцитом сумарний обєм фрагментів ДНК зростає майже в два рази (табл. 7).

Очевидно, реакція тканини надниркових залоз у значній мірі визначається її генетичними особливостями і, відповідно, біохімічними змінами, що відбуваються в тканині внаслідок патологічного перетворення. Слід відзначити, що ступені фрагментації ДНК у пухлинних і умовно нормальних ділянках у межах однієї залози тканин кори надниркових залоз, одержаних від хворих альдостеромою, феохромоцитомою, андростеромою в значній мірі різняться між собою (табл. 7). Різна інтенсивність апоптичних явищ у клітині може пояснюватися перебудовою генетично детермінованих процесів у патологічно змінених клітинах у порівнянні з нормальною тканиною [Bernini et al., 2002].

Таблиця 7

Порівняльна характеристика інтенсивності апоптичних процесів (%) у пухлинних і умовно нормальних ділянках в межах однієї залози під впливом суміші NAE

Примітка. За 100 % прийнята фрагментація ДНК за умов інкубації без NAE, ** - вірогідна різниця з контролем без NAE, р < 0,01, критерій Стьюдента; n = 4.

Найбільш чутливими до дії NAE пухлинами виявилися альдостероми, фрагментація ДНК в них збільшується більш ніж на 30 % порівняно з умовно нормальною тканиною. У випадку андростером фрагментація ДНК залишається без змін, у випадку феохромоцитом чутливою до дії NAE є умовно нормальна тканина надниркових залоз. Відомо, що при феохромоцитомі істотно посилюється кортикостероїдогенез в прилеглій адренокортикальній тканин [Wolf et al., 2005]. Цей факт може бути поясненням встановленого нами збільшення фрагментації ДНК під впливом NAE майже на 100 % саме у випадку феохромоцитоми (табл. 7).

Той факт, що N-ацильовані похідні етаноламіну здатні вибірково вражати пухлинну тканину альдостером, помітно не впливаючи і не завдаючи шкоди нормальній, може бути підґрунтям для розробки нових підходів оптимізації хіміотерапії пухлин надниркових залоз.

Дослідження участі протеїнкіназ у перенесенні регуляторного сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах

Іони калію відіграють значну роль в регуляції адренокортикальної функції. Відомо, що К⁺ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є тлом, що модулює ефекти інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну [Chen et al., 1999; Pratt et al., 1989]. Проте регуляція синтезу мінералокортикоїдів іонами калію є дослідженою значно гірше порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є Са²⁺/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condon et al., 2002; Ganguly et al., 1992]. В той же час в регуляції найважливіших метаболічних функцій клітини, зокрема в регуляції стероїдогенезу, значну роль відіграють циклічні нуклеотиди. Ми провели дослідження на умовно нормальних та гіперплазованих тканинах кори надниркових залоз людини, які свідчать про участь в трансдукції регуляторних сигналів іонів К⁺ cAMP, ПКА та ПКС. Для того щоб прослідкувати можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах людини, ми вивчали розподіл основної ізоформи ПКС у корі надниркових залоз, ПКС-б, в субклітинних фракціях після інкубації зрізів в середовищі з різним вмістом К⁺. Встановлено, що кількість ферменту за присутності іонів калію в інкубаційному середовищі є більшою в мікросомах. Таке накопичення ПКС-б в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. В цитозольній фракції адренокортикоцитів вміст б-ізоформи ПКС залишається без змін.

Ми також вивчали зміни активності ПКС у субклітинних фракціях зрізів адренокортикальної тканини людини під впливом змін концентрації іонів калію. Суттєва активація ПКС спостерігалась в мікросомній фракції: при концентрації калію 8,5 мМ активність ПКС визначалась у мікросомах на рівні 11,09 2,33 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з кіназною активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К⁺. Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах адренокортикоцитів морських свинок показало значне посилення її активності внаслідок дії К⁺ [Пушкарьов, 2005]. Натомість, інші протеїнкінази в ядрах не активувались, або їх активність навіть мала тенденцію до зменшення.

Активація ПКС в ядрах, можливо, повязана з фосфорилюванням деяких транскрипційних чинників, а через них посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та білки-регулятори стероїдогенезу (StAR). Таким чином, активація ПКС зі збільшенням концентрації К⁺ спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок [Пушкарьов, 2005], які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну фосфоінозитидів та мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо і значною мірою визначає рівень синтезу альдостерону в клубочковій зоні залози. Щоб оцінити можливу роль cAMP-залежної ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К⁺ в корі надниркових залоз людини, визначали вміст нуклеотиду в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі.

Аналіз залежності продукції cAMP корою надниркових залоз людини від концентрації іонів калію дозволив продемонструвати, що при збільшенні концентрації іонів калію до 8,5 мМ продукція cAMP зростає в 4 рази і становить 0,62 ± 0,15 пмоль/мг тканини. В умовах відсутності калію вміст cAMP становить 0,14 ± 0,02 пмоль/мг тканини. Зростання кількості cAMP також спостерігалось за умов стимуляції тканини калієм в клітинах кори надниркових залоз морських свинок [Pushkarev, Mikosha, 1991].

Крім того, у присутності інгібітору ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМ К⁺ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося [Пушкарьов, 2005]. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К⁺ в адренокортикоцитах морських свинок, як це спостерігається при дії АКТГ. Пряме визначення активності ПКА в мікросомній фракції за інтенсивністю фосфорилювання специфічного субстрату - кемптиду показало, що калій активує цю кіназу, хоча амплітуда активації виявилась нижчою порівняно з ПКС. Як і у випадку ПКС, при концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА в мікросомній фракції знижується, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ активність ПКА також зростає до рівня 4,16 0,83 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка. Активність ПКА в цитозольній фракції зростає при збільшенні концентрації калію. У фізіологічних умовах активність ПКА в цитозольній фракції визначалася на рівні 2,11 0,14 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ вона сягала 3,04 0,38 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка.

На відміну від цитозолю та мікросом, активність ПКА в ядрах, при визначенні фосфорилювання білків в безклітинній системі, практично не змінюється [Пушкарьов, 2005]. Останній факт може свідчити про те, що основні субстрати цієї кінази знаходяться в цитоплазмі адренокортикоцитів.

Таким чином, базуючись на одержаних нами даних та даних літератури можна стверджувати, що перенесення регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах є значно складнішим процесом, ніж вважалось до цього часу. Ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. У перенесенні активуючого сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах можуть брати участь cAMP-залежна протеїнкіназа [Pushkarev, Mikosha, 1991], кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condon et al., 2002], протеїнкіназа С [Betancourt-Calle et al., 2001; Pushkarev et al., 1994]. В результаті активації протеїнкіназ та фосфатаз відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.

Отже, можна вважати, що отримані результати обґрунтовують нову концепцію щодо участі регуляторів адренокортикальної функції у формуванні адаптаційних реакцій, які здійснюються безпосередньо наднирковими залозами. Аналіз механізмів взаємодії на молекулярному рівні агоністів, причетних до регуляції адренокортикальної функції і проліферації клітин кори надниркових залоз, переконливо доводить, що ця взаємодія реалізується шляхом низки трансрегуляторних впливів систем внутрішньоклітинних месенджерів, починаючи з першої ланки їхньої дії - рецепції на плазматичній мембрані.

ВИСНОВКИ

1. Обґрунтовано концепцію мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу в корі надниркових залоз, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, та їх трансрегуляторні впливи. Універсальність мережі месенджерних систем, які запускаються в адренокортикоцитах різними регуляторами - кортикотропіном, естрогенами, пролактином, іонами калію, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламіну, забезпечують реалізацію специфічної функції клітин кори надниркових залоз - синтез кортикостероїдних гормонів.

2. Збільшення активності cAMP-залежної протеїнкінази А, а також протеїнкінази С та її б-ізоформи в клітинах кори надниркових залоз та субклітинних фракціях під впливом АКТГ, естрадіолу, іонів калію свідчить про залучення до забезпечення їхньої регуляторної дії обох кіназних систем.

3. До подальшого перенесення сигналу АКТГ залучено сигнальний каскад протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також ядерні транскрипційні фактори. Серед них найбільш вагома роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK та ядерному фактору транскрипції с-jun.

4. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, оцінювані за зниженням вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією протеїнкінази С.

5. Встановлено дозозалежність зниження специфічного звязування тропних гормонів (АКТГ та пролактину) мембранами адренокортикоцитів за дії адренокортиколітичного препарату хлодитану.

6. В корі надниркових залоз людини основною ізоформою протеїнкінази С є Са²⁺/фосфоліпід-залежна б-ізоформа. Її експресія в адренокортикальній тканині істотно перевищує експресію інших досліджуваних ізоформ. Транслокація б-ізоформи з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз.

7. В субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини експресуються всі Са²⁺-незалежні ізоформи протеїнкінази С.

8. Збільшення експресії тирозинкінази РТК спостерігається в адренокортикальних карциномах людини. Цей факт може бути теоретичним підґрунтям для використання експресії рецепторних тирозинкіназ як діагностичного маркера злоякісності при адренокортикальній патології.

9. Естрадіол бере участь в регуляції глюкокортикоїдної функції кори надниркових залоз. Дозозалежна стимуляція секреції 11-гідроксикортикостероїдів в дослідах in vitro на первинній культурі надниркових залоз свідчить про пряму дію гормону на адренокортикоцити. Про залучення до опосередкування дії естрадіолу in vivo центральних ланок гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи свідчить збільшення рівня кортикостероїдів в плазмі крові та нуклеїнових кислот в корі надниркових залоз, гіпофізі та гіпоталамусі.

10. Естрадіол in vitro та in vivo посилює продукцію кортикостероїдів в корі надниркових залоз. До реалізації цих ефектів в адренокортикальних клітинах залучені cAMP-залежна протеїнкіназа А та протеїнкіназа С.

11. Естрадіол викликає збільшення в корі надниркових залоз вмісту МАР-кінази ERK1/2 та ядерного фактора транскрипції с-fos.

12. Адреномодуляторна дія N-ацилетаноламінів in vitro виявляється у стимуляції включення міченого холестерину до синтезованих корою надниркових залоз щурів альдостерону та кортикостерону.

13. Виявлено модулюючий ефект N-ацилетаноламінів in vitro на функцію кори надниркових залоз: підвищення рівня 11-гідроксикортикостероїдів, що синтезуються корою надниркових залоз самок щурів, та зниження вмісту 11-гідроксикортикостероїдів в середовищі інкубації тканини кори надниркових залоз людини та самців щурів. N-ацилетаноламіни здійснюють свій стимулюючий ефект на кору надниркових залоз шляхом активації протеїнкінази С; зменшення стероїдогенезу забезпечується пригніченням утворення cAMP та протеїнкінази А.

14. N-ацилетаноламіни здатні викликати апоптоз або некроз в тканинах пухлин надниркових залоз людини.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тронько М.Д., Ковзун О.І., Пушкарьов В.М. Механізми регуляції стероїдогенезу в корі надниркових залоз. К.: Центр навчальної літератури, 2006. 304 с. (Дисертантом особисто написано розділи 1, 2.1, 2.3.3, 2.5).

2. Саутин Ю.Ю., Тронько Н.Д., Ковзун Е.И., Микоша А.С. Анаболическое действие пролактина на метаболизм фосфатидилхолина в адренокортикоцитах морских свинок // Укр. биохим. журн. 1991. Т. 63, № 5. С. 73-78. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).

3. Mikosha A.S., Sautin Yu.Yu., Kovzun E.I., Povorotnij V.Yu., Tronko N.D. Inhibitory effect of adrenocorticolytic drug mitotane on corticotropin and prolactin binding by isolated cells and microsomal membranes of human and guinea pig adrenocorticocytes // Экспериментальная онкология. 1997. Т. 19, № 2. С. 162-166. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).

4. Mikosha A., Kovzun O., Zhukov A., Gulaya N. Effect of dopamine and long-chain N-acylethanolamines on steroidogenesis in rat adrenal gland in vitro // Med. Sci. Res. 1998. N 2. Р. 85-88. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, зроблено внесок в аналіз результатів та написання статті).

5. Ковзун О.І. Розширення уявлень про регуляцію функції кори надниркових залоз різними агоністами // Ендокринологія. 2002. Т. 7, № 1. С. 108-113.

6. Микоша А.С., Ковзун Е.И., Гринченко Е.Н. Эстрадиол-17 активирует образование кортикостероидов и тормозит пролиферацию культивируемых клеток надпочечников свиней // Укр. біохім. журн. 2003. Т. 75, № 1. С. 29-32. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проаналізовано результати, написано статтю).

7. Tronko N.D., Kovzun O.I., Kovalenko A.E., Mikosha A.S. Subcellular distribution of protein kinase C isoforms in human conditionally normal and tumor adrenal tissues // Ендокринологія. - 2004. - Т. 9, № 1. - С. 9-15. (Дисертантом самостійно проведено дослідження, проаналізовано експериментальні дані, написано статтю).

8. Ковзун О.І., Тронько М.Д., Микоша О.С. АКТГ активує in vitro протеїнкінази А та С у корі надниркових залоз людини // Укр. біохім. журн. 2005. Т. 77, № 6. С. 97-100. (Дисертантом самостійно сплановано експерименти, проаналізовано результати, написано статтю).

9. Ковзун О.І. Загальна активність протеїнкінази С та розподіл її б-ізоформи у пухлинах надниркових залоз людини // Доповіді НАН України. 2005. № 10. С. 166-170.

10. Ковзун О.І. Участь циклічного АМФ в перенесенні регуляторних сигналів естрогенів у пухлинах надниркових залоз людини // Буковинський мед. вісник. 2005. Т. 9, № 2. С. 123-125.

11. Пушкарьов В.М., Ковзун О.І., Тронько М.Д., Костюченко Н.М., Микоша О.С. Участь фосфоінозитидів, протеїнкіназ С та А у передачі регуляторного сигналу К⁺ в адренокортикальних клітинах людини // Укр. біохім. журн. 2005. Т. 77, № 1. С. 65-71. (Дисертантом самостійно здійснювався аналіз літератури, сплановано експерименти, проведено визначення активності протеїнкіназ, статистичну обробку та узагальнення матеріалів, зроблено внесок у написання статті).

12. Ковзун О.І. Шляхи внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів естрадіолу в корі надниркових залоз людини // Доповіді НАН України. 2006. № 8. С. 187-191.

13. Ковзун О.І., Пушкарьов В.М. Роль протеїнкінази С у внутрішньоклітинних механізмах регуляції функціонального стану кори надниркових залоз в умовах норми та при патології // Укр. біохім. журн. 2006. Т. 78, № 4. С. 54-66. (Дисертантом самостійно здійснювався аналіз літератури, узагальнення даних, написано статтю).

14. Ковзун О.І., Костюченко Н.М. N-ацильовані похідні етаноламіну ініціюють апоптоз в тканинах надниркових залоз людини // Медична хімія. 2006. Т. 8, № 1. С. 21-24. (Дисертантом самостійно сплановано експерименти, проаналізовано результати, написано статтю).

15. Ковзун О.І., Грінченко Є.М., Калинська Л.М., Микоша О.С. Вивчення впливу естрадіолу бензоату in vivo на вміст РНК і ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі самців щурів // Ендокринологія. 2006. Т. 11, № 2. С. 213-218. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти, проаналізовано результати та написано статтю).

16. Тронько М.Д., Ковзун О.І., Грінченко Є.М., Микоша О.С. Вплив естрадіолу на синтез кортикостероїдів, активність протеїнкіназ А та С в корі надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів // Фізіол. журн. 2006. Т. 52, № 6. ...........